如何进行TCR的基因组编辑？

　　

01. 介绍

今天，许多T细胞工程方法仍然使用病毒载体来传递感兴趣的转基因。然而，精确基因组编辑领域现在提供了将转基因精确整合到特定基因组位点的可能性，而逆转录或慢病毒转导则产生可变转基因拷贝数和表达水平的随机整合。

 

基因组编辑在工程T细胞治疗领域的兴趣是多方面的，包括

(1)消除内源性TCR和HLA特征(例如，通用供体CD19 CAR - T细胞或UCART19)，

(2)消除内源性TCR，增强导入转基因TCR的表达和功能，避免交叉反应;

(3)消除免疫抑制受体，设计对免疫检查点配体的抗性;

(4)将CAR或TCR转基因插入TCR位点，在消除内源性TCR特异性的同时，利用转基因表达的生理调节，

(5)发现增强组合免疫工程的新靶点。

 

增强TCR转基因T细胞功能的工程策略

 

 

---

02. 消除内源性TCR特异性

 

几种可编程的基于核酸酶的基因组编辑工具已经开发出来，用于通过非同源端连接(NHEJ)诱导双链断裂和DNA修复来靶向破坏内源性TCR位点。

这些工具包括大范围的核酸酶（meganucleases）、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)、megaTAL核酸酶，以及最近聚集性调节间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9 (CRISPR /Cas9)。

Cas核酸酶由一个短导RNA引导到目标DNA序列，通过沃森-克里克碱基配对识别目标DNA，并允许多路复用，而其他酶依靠蛋白质-DNA相互作用实现目标特异性。

在破坏ZFN的两个内源性TCRβ不变区(TRBC1和TRBC2)和TCRα不变区(TRAC)的基础上，转基因WT-1特异性TCR产生的肿瘤随后被慢病毒转导到无内源性TCR特异性的T细胞。

与单纯由慢病毒转导产生的TCR+T细胞相比，TRAC/TRBC编辑的TCR+T细胞在体外和体内均具有亲和力增强、抗肿瘤功能增强、非特异性同种异体反应性显著降低的特点。

这篇开创性的论文提供了一个概念，即破坏内源性TRAC和TRBC位点显著提高了TCR位点编辑的T细胞的安全性(通过消除TCR错配)、亲和力和抗肿瘤功能。

随后，该团队发现，基于ZFNs的TRAC位点单次编辑和慢病毒TCR转导足以产生安全、高活性的肿瘤靶向T细胞，其溶液更适合临床转化。

TALEN、meganuclease、megaTAL nuclease和CRISPR/Cas9系统也被用于高效生成TRAC和/或TRBC位点编辑的T细胞。

比较各种平台，临床级制造的可扩展性，效率和脱靶活性评估TRAC位点的破坏，并进一步优化。

与单独的慢病毒转导相比，CRISPR/ cas9介导的TRBC1/2破坏和转基因γδ-TCR介导的慢病毒转导也导致γδ-TCR重定向细胞更有效的抗肿瘤功能。

 

---

03. 基于多重CRISPR/Cas9的基因组编辑

 

为了产生抗PD1介导抑制的异基因通用供体TCR或CAR T细胞，通过同时破坏TRAC、TRBC、β2-微球蛋白（B2M）和PDCD1位点，开发了基于CRISPR的/Cas9多重编辑方法，并结合CAR慢病毒转导。在临床前模型中，联合PD1破坏进一步提高了编辑的CAR T细胞的抗肿瘤活性。

其他免疫检查点的破坏已经在CAR T细胞中进行了研究，包括CTLA-4单独使用以及与PD-1和LAG-3联合使用。

最近，报道了首个使用CRISPR/Cas9工程NY-ESO-1 TCR特异性T细胞治疗晚期难治性肉瘤和多发性骨髓瘤的人I期临床试验。

与之前的NY-ESO-T试验相比，该试验的两个主要目标是(1)提高NY-ESO-1 TCR T细胞的安全性和有效性，(2)限制T细胞耗尽、TCR和传统慢病毒转导的发展。

为此，我们采用CRISPR/Cas9多种方法干扰TRAC、TRBC和PDCD1基因座，以降低混合TCR异质二聚体形成的可能性，避免TME中检查点配体介导的t细胞免疫抑制。

该试验在3例患者中证明，使用CRISPR/Cas9和慢病毒转导对T细胞进行多重基因组编辑是可行和安全的。

在没有编辑的情况下，注入的T细胞的持久性超过了之前用慢病毒转导的NY-ESO-1 TCR+ T细胞的临床结果，并且没有观察到预先存在的对Cas9的免疫反应。

到目前为止，脱靶编辑尚未产生与安全性相关的副作用，但患者需要更长的随访时间。这些有希望的结果显然值得进一步研究。

 

---

04. 将转基因定向递送到指定的基因座

 

同源定向DNA修复(HDR)可用于特异性地将供体DNA模板(编码感兴趣的序列)插入目标基因组位点。

例如，基于CRISPR的CD19 CAR与腺相关病毒6 (AAV6) TRAC位点的靶向整合，使得CAR的表达一致，增强了CAR-T细胞在体内外的抗肿瘤功能，同时消除了内源性TCR特异性。

与构成活性启动子相比，将CAR转基因置于内源性TCR启动子的控制下，会导致更多的生理上的CAR表达和抗原刺激的转换，从而延迟最终分化的枯竭的CAR - T细胞的发育。

也有报道称MegaTAL和AAV6介导的CAR插入到TRAC或CCR5位点。

使用非病毒DNA供体模板实现了肿瘤靶向TCR插入到TRAC位点，与AAV6载体相比，显著提高了该方法的灵活性。

但是，HDR的成功率很低，需要额外的优化。研究了5种具有抗病毒或抗肿瘤特异性的TCR。

有趣的是，使用这种方法，单独的TRAC位点编辑并不能完全消除混合TCR二聚体的形成，需要额外的TRBC位点破坏。重要的是，转基因TCR的原位插入在所有评估的5个不同TCR中产生了几乎是生理的TCR调节动力学，强调了这些结果在不同TCR中的高重现性。

CRISPR工具也可以用来设计人工T细胞信号通路，通过内源性转录调节特异性反应来增强抗肿瘤T细胞功能。

例如，将IL-12p70插入IL-2Rα或PDCD1位点，将产生具有抗原依赖性IL-12p70产生的T细胞，从而增强抗肿瘤功能，但无明显毒性。

因此，劫持特定位点的转录调控系统可以实现对转基因表达的严格控制，提高功能性T细胞输出的安全性和特异性。

 

---

05. 结论

 

利用基因组工程工具更快地发现和验证新方法。基因电路的精确修饰将为控制转基因T细胞的功能开辟新的可能性，对已识别的T细胞基因位点进行基因组编辑的第一个治疗性应用已经进入临床。

我们相信，随着我们了解如何最好地操纵人类免疫系统来对抗癌症，这些新进展中的一些可能会导致临床突破。

 

原文检索：Cells 2020, 9, 1485; doi:10.3390/cells9061485

https://en.wikipedia.org/wiki/Transgene

(来源:互联网,仅参考)

---

---