北京大学白凡团队合作成果：细菌中存在液-液相分离 无膜液态蛋白质聚集体解析

北京大学生物物理学家白凡团队和约克大学一项合作研究发现，细菌细胞在应激反应中因液相分离形成的液体分子聚集体能促进细胞的生存。

　　

混合溶液中出现两种截然不同的液体分层——比如在沙拉酱中油和醋分离时——物理学家称之为液-液相分离(LLPS)。除了调味品，这种相分离也发生在微观尺度上，在细胞内部，液相分离可集中生物分子，促进它们的反应。液-液相分离可能是基本细胞过程中的关键现象。真核细胞中液-液相分离 (LLPS) 的作用已有报告，例如驱动真核细胞中无膜区室的形成，包括 P 颗粒、核仁、异染色质和应力颗粒，提高相关生物分子的浓度、从而提高生化反应效率、保护 mRNA或蛋白质以促进细胞在压力下的存活。液-液相分离的可逆性特征通常对几种微环境因素高度敏感，在没有细胞膜的情况下，细胞响应生理学变化、将复杂细胞质成分进行动态划分能够为细胞提供潜在的好处。与真核生物相比，细菌细胞质更加拥挤，并且通常缺乏膜结合细胞器。尽管如此，其细胞大分子的定位是高度有组织的，并表现出不均匀的空间分布。在原核生物中液相分离发生的时间、方式和原因仍然存在疑问。

细菌中的蛋白质聚集体已经被鉴定了几十年，但它们的功能作用仍然存在争议。在细菌中蛋白质聚集体最初认为是在不利的内在或环境压力下导致错误折叠的蛋白的集合。这些蛋白质聚集体显示出缓慢且有限的应激后分解，并在母细胞中保留了许多代。然而，最近的研究表明，蛋白质聚集体有助于细菌的不对称分裂并形成种群异质性，从而增加细菌的适应性。

北京大学生物物理学家白凡(Fan Bai)和约克大学(University of York)的马克·利克(Mark Leake)此前曾证明，当细菌受到抗生素治疗的压力或ATP(一种分子能量的形式)可用性减少时，它们就会在大肠杆菌细胞内形成蛋白质凝集物，他们称之为聚合体。在这个团队最新的研究中，他们调查了聚集体形成的动力学和它们的功能。研究结果发表在10月20日《科学进展》杂志上。

研究小组使用荧光标记的蛋白质，这些蛋白质之前已经显示在聚集体中，研究人员发现，ATP耗尽后，聚集体会在数小时内逐渐形成，通常会在杆状细菌的两端各形成一个。他们使用一种特殊的荧光显微镜，这种显微镜被称为快速超分辨单分子跟踪，它可以跟踪单个标记蛋白的运动。他们还显示，在聚集体中，蛋白质以一种表明它们在液体环境中移动的方式自由扩散。

荧光标记蛋白(红色和绿色)显示的聚集体形成     大肠杆菌细胞  约克大学的马克·利克提供

进一步的证据表明，与之前报道的错误折叠蛋白质形成的蛋白质聚集体不同，aggresomes 是动态的、可逆的结构，在压力条件下形成并在细胞经历新鲜生长培养基时分解。荧光标记的蛋白质可以从聚集体的一半扩散到另一半。此外，计算机模拟显示，聚集体的形成不需要能量输入，也就是说，蛋白质团在“热平衡”下发展，Leake说，这是真正的LLPS的指示。

虽然研究小组还不知道这些聚集体是如何形成的，但他们怀疑这可能与ATP本身有关。Leake解释说，ATP分子是一种助溶剂，可以帮助将包括部分蛋白质在内的疏水分子溶于水环境。因此，它的耗尽可能会促使疏水蛋白聚集在一起。不管机制如何，“我们论文的主要发现是，在聚集体中，蛋白质倾向于在一起，但不是严格地在一起。它们仍然显示出一定程度的运动。这就是为什么我们称它为液态蛋白质液滴，而不是固态蛋白质球。”

研究人员利用实验和多尺度建模来确定其空间和时间控制的分子生物物理学，推断aggresomes在细菌适应性中的关键作用。通过时间分辨显微镜对单个蛋白质和合并 aggresomes 确定，aggresomes 是直径数百纳米的无膜液滴，在细菌细胞质中的热平衡下、扩散蛋白质聚集后出现的相分离。这些发现意味着细菌细胞可能在其应激适应系统和应激后复苏中利用相变和分离过程。相变和分离对某些参数如pH、温度、盐和分子相互作用的变化高度敏感。Aggresomes 包含多种类型的内源性蛋白质，在不同的特征时间尺度上被整合到 aggresomes 中，表明 aggresomes 的组成随时间动态变化。因此，由 ATP 消耗诱导的 aggresomes 在组成和物理状态方面是高度异质的。

研究还分析了aggresomes对细菌生存的作用。在各种抗生素处理下，在菌株的早期稳定期——没有出现 aggresomes时，所有菌株具有相似的抗生素耐受性。与聚集体形成被抑制的菌株相比，野生型菌株在抗生素压力下形成聚集体aggresomes，并显示出更高的持久性比率，表明适应性增加。当用噬菌体入侵攻击细菌时，野生型表现出相同的生存优势。通过 LLPS 形成的聚合体促进了细菌在一系列剧烈压力下的存活。 LLPS 是一种高度可逆和敏感的方式，可以在没有细胞膜的情况下分隔细胞质。先前的一项工作表明，随着细胞从代谢活跃状态转变为休眠状态，细菌细胞质的物理状态从流体状显著变化为玻璃状。聚集体的形成隔离了许多对细胞功能至关重要的蛋白质，可能导致不同生物过程的关闭，细胞进入休眠状态。聚集体的形成不需要外部自由能。一个可能的解释 ATP 不仅可以为细胞内的过程提供能量，而且还可以作为水溶助剂来增加特定蛋白质的溶解度；因此，减少细胞 ATP 可能有利于 LLPS。这种使用 ATP 的调节方法可能是使用 LLPS 的其他几个生物过程中一个重要且反复出现的主题。

细菌细胞如何检测压力并具体而及时地响应压力是一个重要的问题。研究人员推测，细菌细胞会根据不同的应激强度和持续时间来调整聚集体的材料组成和特性，并设定应激反应的强度和恢复的长度。这也为调和蛋白质聚集生物学功能的争议提供了一个潜在的解释。细菌中的蛋白质聚集可以由多种压力诱导，例如饥饿、热休克、氧化压力，甚至抗生素治疗。需要仔细重新评估细菌蛋白质聚集体或凝集物的组成和物理状态，以探索它们在压力下的详细生物学功能。

比利时鲁汶大学(KU Leuven)研究蛋白质聚集的学者Frederic Rousseau没有参与这项研究，他认为研究结果强调了“LLPS对于细胞生命及其起源是多么重要”。

密歇根大学的化学家和生物物理学家朱莉·比廷(Julie Biteen)说，传统的显微镜方法已经揭示了细菌中可能存在由液相分离(即所谓的condensates)引起的蛋白质聚集，但了解它们的形成机制以及它们是液体还是固体一直是一个真正的挑战。她不是该研究小组的成员。她认为这篇新论文是“一篇真正重要的论文……演示了如何使用最先进的超分辨率成像来解决这些问题。”某种程度上，显微镜衍射极限是两个物体可以被分开或分辨的最小距离(荧光显微镜大约200纳米)，这种凝集（condensates）只比显微镜的衍射极限稍大。

麦吉尔大学的斯蒂芬妮·韦伯(Stephanie Weber)研究细胞的空间组织，但没有参与这项研究。她说:“它告诉你它们是如何形成的，以及是什么样的分子相互作用促使它们聚集。”她解释说，如果它们是固体的，它们就不会那么动态，限制了它们内部蛋白质所能进行的相互作用或反应的类型。此外，与固体结构相比，液滴可以快速形成和溶解，所以对于生活速度快、复制速度快、可能会经历周围环境突然变化的细菌，比如抗生素或其他形式的压力，“这可能是一个聪明的策略，以配合他们快速变化的环境的时间表。”“这项研究不仅显示了凝聚物在细菌中形成，而且还显示了它们对生存和抗压能力的功能性影响，这真是令人兴奋。”然而，除了弄清楚触发LLPS的机制外，准确了解液体团中包含的蛋白质将是关键。“这是一个非常重要的问题。”

研究小组进一步证明，这些聚集体并非大肠杆菌所独有，其他八种革兰氏阴性细菌的ATP减少时也会形成，而且这些聚集体促进了细胞的生存。通过筛选突变菌株库发现了某些突变的大肠杆菌不能形成聚集体，当ATP耗尽时存活率较低。由于突变只会损害聚集体的形成，而没有完全消除它，研究人员发现如果一个突变细胞有可观察到的聚集体，它们比那些没有的更有可能生存。