腺相关病毒的包装容量太小？四种方法帮你解决问题

腺相关病毒（AAV）的许多功能使其成为良好的病毒载体，但它只能容纳4.7 kb左右的外源DNA片段。尽管许多基因都在此范围内，但有些酶的确不合适。那么，如何将大片段放入AAV载体中呢？人们的应对措施是将转基因切割成较小的片段。

　　

腺相关病毒（AAV）的许多功能使其成为良好的病毒载体，但它只能容纳4.7 kb左右的外源DNA片段，容量仅为慢病毒和腺病毒载体的一半。尽管许多基因都在此范围内，但有些酶的确不合适。那么，如何将大片段放入AAV载体中呢？人们的应对措施是将转基因切割成较小的片段。

2008年，意大利的研究人员直接将大约9 kb的超大基因组包装到AAV中。他们发现，这个AAV载体在体外和体内成功介导了全长转基因的转导和表达。但在不久后，三个研究小组尝试重现这些结果，并发现即使包装了更大的片段，基因组的物理大小仍为4.7 kb。尽管如此，转导后仍然产生了较大的功能产物。

这是怎么回事？研究人员推测，在包装时，过大的AAV基因组会被片段化或截短，而在转导后，部分基因组会相互补充，又恢复完整的表达框。根据这一原理，研究人员开发出几种分割载体的策略，从而插入更大片段的DNA。

分割AAV载体的方法

研究人员通常是先将基因分成两部分（A部分和B部分），然后将每个部分独立包装到AAV中。当细胞被A部分和B部分的AAV同时感染时，这些片段重新组装，并产生全长基因。Addgene的Beth Kenkel近日介绍了四种分割方法及其缺点。

1. 重叠法

（图片来自Addgene）

原理：

对于重叠法，A部分和B部分之间通常拥有400-1,400 bp的同源区域。人们普遍认为，这些重叠区域会发生某种形式的同源重组（HR），但确切的机制还不清楚。

缺点：

重叠载体的转基因表达水平通常等于或高于单个超大载体。血清型和细胞类型的组合可能会对转基因的表达状况产生重大影响，因为这两个变量都会影响细胞是否与两种载体的多个拷贝一起共转导。

应用实例：

Fred Hutchinson癌症研究中心的研究人员曾利用440 bp或1,000 bp重叠的载体，将碱性磷酸酶基因导入小鼠的气道上皮细胞。这种载体转导了大约10%的细胞，与单个AAV载体的转导率相似。

华盛顿大学医学院的研究人员曾经使用带有372 bp重叠的分割载体，将迷你抗肌萎缩蛋白（mini-dystrophin）基因导入小鼠肌营养不良模型中。尽管迷你抗肌萎缩蛋白的表达水平低于正常肌肉中的野生型抗肌萎蛋白，但经过治疗的小鼠在肌肉生理机能上有所改善。

2. 反式剪接法

（图片来自Addgene）

原理：

反式剪接法在两个片段上分别连接了剪接位点的供体序列和受体序列。转基因载体的A部分包含启动子和转基因的5’端，以及剪接位点的供体序列。B部分则包含剪接位点的受体序列，以及转基因的3’端。当两种病毒转导细胞时，如果A部分和B部分形成异源二聚体，则两部分pre-mRNA的剪接将重新组成全长的转基因。

缺点：

反式剪接发生在反向末端重复区（ITR），这可能是一个限速步骤，但外显子剪接位点序列的优化可以提高反式剪接的速率。反式剪接并不一定优于单个超大的AAV载体。

应用实例：

密苏里大学医学院的研究人员利用反向剪接法，将6 kb迷你抗肌萎缩蛋白的基因导入小鼠肌营养不良模型中。他们测试了三种不同的剪接位点供体和受体序列，并采用了最佳序列。之后，大约80%的肌肉细胞能够表达迷你抗肌萎缩蛋白蛋白。

3. 混合法

（图片来自Addgene）

原理：

混合法将重叠法和反式剪接法结合在一起。A部分包含启动子、转基因的5’端、剪接供体序列和同源区域。B部分则包含同源区域、剪接受体序列、转基因的3’端。全长基因可通过重叠或反式剪接机制而形成。

两个载体的剪接位点供体和受体序列以及同源区域可来自转基因的内源性内含子，也可由非内源性序列组成，如77 bp的高度重组同源序列，来自丝状噬菌体F1。

缺点：

同源序列的选择会影响转基因的表达水平，因此可能需要针对每个独特的应用来优化。同时，在使用这种方法时，人们观察到较小片段的表达。尽管这些片段没有功能，但它们可能产生显性失活效应或毒性。一个比较好的解决方案是在5’剪接供体的上游和3’剪接受体的下游添加读框内降解序列，以防止截短蛋白的积累。

应用实例：

密苏里大学哥伦比亚分校的研究人员曾利用带有872 bp同源重组序列的混合分割载体，将LacZ基因导入小鼠肌肉内。通过测定β-半乳糖苷酶的活性，他们发现，混合载体的表达量是单个载体的81%，但明显高于重叠法（34%）或反式剪接法（62%）的载体。

4. 顺序的同源定向修复

（图片来自Addgene）

原理：

这种方法利用CRISPR/Cas9技术，通过两次顺序的同源定向修复（HDR）来提供大的供体模板。供体A包含：与基因组整合位点同源的400 bp同源臂（HA）、转基因的A部分、gRNA靶向位点，以及stuffer DNA序列。供体B包含：400 bp同源臂和转基因的B部分。通过两次连续的CRISPR介导的HDR事件，形成更大的供体模板。

缺点：

转基因的表达效率各有不同，原代T细胞、造血干细胞和祖细胞中只有10%表达，而K562细胞系中有40%表达。由于这种方法依赖双链DNA断裂的修复，因此若第一次HDR事件后的非同源末端连接（NHEJ）破坏了gRNA目标位点，则不会发生第二次HDR事件。另外，供体A也可能产生截短的蛋白质，需要避免这种情况。

选择何种方法？

作者认为，与重叠法和反式剪接方法相比，混合法略有优势，因为转基因有两种重组方法，但是总的来说，目前还没有一种理想的分割载体系统。分割载体的转基因表达效率总是不一致。随着未来对AAV的了解加深，人们有望改善分割载体的策略，实现更高效更一致的基因表达。（生物通 薄荷）