单细胞TCR-Seq技术——更高效的TCR a/b 链配对分析

书接上回，这一篇我们来聊一聊“单细胞TCR-Seq”技术。
点击下面的文章标题，带您快速回顾上一篇精彩介绍。
《50篇20分↑文章，网友：免疫组库分析要火？！》

免疫组库分析为何要用到单细胞测序技术？

下面的示意图为我们展示了单细胞测序技术对于TCR-Seq而言的重要性：

通过对大量T细胞进行TCR测序分析，有助于理解TCR免疫组库的多样性、TCR介导的抗原特异性识别，以及适应性免疫的相关机制。然而，这样的研究方式虽然可以完成大量T细胞群体中克隆型的表达和相对丰度分析，但是除了一些稀有的细胞群体外，大部分T细胞都没有办法获得正确的受体链特异性配对信息。我们知道，无论T细胞还是B细胞，在发挥特异性识别作用时，需要受体链特异性配对，发挥功能。T细胞主要是α/β链配对，B细胞则是轻链与重链配对。

 

单细胞TCR-Seq技术正好可以为这个问题带来一种完善的解决方案。对单个T细胞进行测序，一方面可以直接获得单细胞水平下克隆型的多样性信息；另一方面也可以直接对α-β链配对信息进行分析研究。为α-β受体链找到失散的“小伙伴”不再那么艰难！

在《50篇20分↑文章，网友：免疫组库分析要火？！》中，我们介绍了“整合了SMART（Switching Mechanism at 5’end of RNA Template）与5’RACE”的免疫组库NGS文库制备技术，该技术“能显著降低PCR偏差，确保结果反映的是样本的真实情况。并且具有更高的on-target率，能降低测序成本。”接下来，将要介绍的两种单细胞TCR-Seq方法均以该技术为基础，融入更多的精心设计。让我们一睹为快！

1 基于96孔板的建库方法

SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit

该方法用于对分选到96孔板中的单个T细胞进行TCR-Seq。整个流程中设置了多种对照，建立起严格的分析质控体系。此外，精心设计过的混合测序策略，可以将整板的单细胞文库混合后在同一个测序仪流动槽（lane）中进行测序。

实验孔板布局

孔板外的阴性/阳性对照组用于测序文库的质量评估，孔板内的阴性/阳性对照孔用于克隆型鉴定分析时的阈值设定以及对潜在交叉污染的评估。严格的质控只为更好的测序结果。

巧妙的SMART-Seq Indexed Oligo

为了以更经济的方式进行文库测序，通常会将多个文库进行标签标记后混合上样至测序仪。单细胞测序中涉及的文库数量更多，对每个单细胞文库做好标记对下游数据分析工作而言至关重要。通过SMART-Seq Indexed Oligo，可以在转录本cDNA第一链合成时，为同一细胞来源的转录本添加相同“身份标签”—— cell barcode。这样，孔板中同一列的8个细胞样品都有了自己的“身份标签”，他们会被混成12组混合文库进行V(D)J区序列的扩增，并添加上只属于自己组内的index标签序列。

完整的文库结构在这里 ↓↓↓

绿色的Smart Oligo和红色的Indexed Oligo组成了“身份标签”——SMART-Seq Indexed Oligo。

我们通过下面一组针对CD4+ T细胞的实验来看一下SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit性能表现到底如何。

分选到96孔板中的CD4+ T细胞参照实验手册标准流程进行文库构建。使用Miseq测序仪进行测序，双端2×300 bp reads，600 cycles。测序数据分析中，8种SMART-Seq Indexed Oligo的拆分工作通过配套的Human scTCR Demultiplexer软件可轻松完成。软件下载即用，无需安装。进一步的序列比对、克隆型分析通过开源软件MiXCR完成。

（数据来源于Takara Bio USA, Inc.）

至少一条TCR链得到鉴定的比例是92%（81/88 孔），α/β克隆型的鉴定比例是65%（57/88孔），同时鉴定到 α 和 β 链的克隆型比例是73%（64/88孔）。

直接用于测序的文库构建流程、高效的混合测序策略、易用的数据分析软件，SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit帮助您快速上手单细胞TCR-Seq，获得高质量数据！

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2 基于ICELL8 cx单细胞分选系统的建库策略

ICELL8 cx Human TCR a/b Profiling

ICELL8 cx系统通过向微孔芯片中分注微量液体完成单细胞分选和多种单细胞测序文库的构建工作。搭载的荧光成像系统帮助完成活的单细胞挑选。在一张微孔芯片上可以对超过1,000个单细胞同时进行TCR测序文库制备。

高通量单细胞分选系统——ICELL8 cx

  

该方法在微孔芯片中完成单细胞分选，以及cDNA第一链合成。SMART-Seq Indexed Oligo已经预先固定在芯片的微孔中。这样，同一个细胞来源的转录本cDNA可以方便、正确地佩戴上相同的“身份标签”。接下来，将转录本cDNA从芯片收集至离心管内，进行V(D)J区序列扩增、测序接头连接，即得到用于上机测序的单细胞TCR免疫组库分析文库。

我们通过一组实验感受一下这一建库策略的性能表现吧！

选择T细胞、外周血单个核细胞（PBMCs）两种细胞类型，分选与文库构建操作参照实验手册标准流程进行。使用Miseq测序仪进行测序，双端2×300 bp reads，600 cycles。下机数据可以通过配套的ICELL8 scTCR Analyzer软件进行拆分，以及进一步的结果分析。ICELL8 scTCR Analyzer软件下载即用，无需安装，图形化界面使用十分友好，好评！（需要提前配置好Java和Python）

（数据来源于Takara Bio USA, Inc.）

44%的PBMCs检测到了TCR转录本，其中αβ链配对比例占70%；75%的T细胞检测到了TCR转录本，其中αβ链配对比例占63%。

单细胞TCR免疫组库分析在提供丰富克隆型信息的同时，进一步展示了受体链的配对信息。这可以帮助研究人员深入了解T细胞的异质性、可塑性，分析配对方式对TCR抗原特异性识别的影响，设计治疗性抗体等。Takara单细胞TCR-Seq产品引入更多的对照，在处理复杂样品时可以帮助获得更高质量的数据。辅以友好的数据分析软件，让新手也可以从容应对。

通过两期的推送，我们准备了丰富的免疫组库分析知识，希望能为您的研究带来帮助。大家可以将我们的内容添加“收藏”，随时回顾复习~

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单细胞免疫组库研究策略

基于96孔板—Human scTCR profiling策略

基于ICELL8 cx单细胞分选系统—Human TCR a/b profiling策略