三种RNA测序技术怎么选？Nature子刊综述讲明白了！

　　

在过去的十年中，RNA测序（RNA-seq）成为差异基因表达、mRNA差异剪接等研究场景不可或缺的重要手段。随着高通量测序技术的不断发展，RNA-seq的研究技术、分析方法也在不断发展。现在RNA-seq用于研究RNA相关的各方面生物学问题，包括单细胞基因表达、RNA翻译、RNA结构、空间转录学、全转录组、RNA-蛋白互作等。早前 Nature Reviews Genetics 发表了一篇综述，全面介绍了RNA-seq的发展。

转录本是非常多样和复杂的，绝大多数基因不符合“一基因一转录本”的模式，这些基因往往存在多种剪切形式。而基于短读长测序平台的转录组测序，首先把RNA打断成小片段进行测序，然后再通过生物信息的方法进行拼接。因此由于读长的限制，基于短读长测序平台的转录组在组装的过程中存在较多的嵌合体，并且不能准确地得到完整转录本的信息，从而对后面的表达量分析、可变剪接、基因融合等分析造成了较大的影响。因此，科研人员开发出不同的转录组测序技术，以期在不同的场景应用不同的技术来针对性地解决问题。

图1 短读长、长读长和直接RNA测序技术比较[1]

综述中通过比较RNA的短读长测序、长读长测序和直接测序这三种技术发现：短读长测序适合做基因定量，研究基因差异表达；长读长（cDNA）测序适合于研究转录本结构信息，如异构体、可变剪切、基因融合等；RNA直接测序可以研究转录本结构信息和修饰信息，但是对RNA样本要求会更高。

表1 RNA短读长测序、长读长测序和直接测序优劣比较[1]

通过多项对比，文中指出，测序错误率高是长读长测序平台的一大劣势。PacBio测序平台错误类型属于随机错误，这种错误通常可以通过使用CCS（circular consensus sequence）增加测序深度来解决。在一个CCS读长中，cDNA和接头进行环化后，每个cDNA就可以被多次测序，这个cDNA在长读长序列中为subreads。这些subreads被组合后就可以产生一致的序列。分子测序的次数越多，最终的错误率就越低。CCS已经被证明可以将错误率降低到与短读长相当的水平，甚至更低。但是，更多的测序数据量读取了相同的分子，使得读取的唯一转录本变得更少，这又加剧了测序通量的问题。

图2 PacBio平台CCS模式测序结果示意图

现在PacBio平台测序长度不断增长，但是如果采用上述的CCS模式测序全长转录组，无法实现数据量增长得到的insert reads也增长，检测的转录本数量同时增长的效果。基于此，我们开发了多倍通量全长转录组，相较于常规全长转录组测序，相同的数据，可以获得5倍的有效数据，转录本检测数量翻倍！

图3 多倍通量全长转录组建库示意图

多倍通量全长转录组在建库过程中将多条序列随机首尾相连，通过CCS测序，一条CCS read可得到多条转录本，充分利用PacBio平台的长读长并大幅提升Sequel测序全长reads的获得率。而且，多倍通量全长转录组包含了UMI技术，因此在享受高效数据利用的情况下还能进行基因的绝对定量。

RNA直接测序可以获得poly（A）的全长序列，我们的poly（A）全长转录组在获得全长转录组信息的同时，仍可以获得poly（A）的长度信息，并进行poly（A）的长度相关的信息分析。

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参考文献：

[1] Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years[J]. Nature Reviews Genetics, 2019, 20(11): 631-656.