北京地坛医院成军团队发现这两种药物有望治疗肝纤维化

　　

肝纤维化（liver fibrosis）是由多种原因引起的慢性肝损伤所致的病理改变，表现为肝组织内细胞外基质（ECM）过度增生和异常沉积。如果肝纤维化继续发展，终将引起肝硬化疾病。不幸的是，肝移植是终末期肝纤维化的唯一有效疗法。因此，开发新的治疗策略势在必行。

近日，首都医科大学附属北京地坛医院的研究人员分析了乙型肝炎药物TAF和TDF在治疗肝纤维化中的作用和机制，并将结果发表在《Hepatology International》杂志上。文章通讯作者为北京地坛医院的成军教授。

富马酸替诺福韦酯（TDF）是一种核苷酸逆转录酶抑制剂，适用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗。富马酸丙酚替诺福韦（TAF）作为TDF的替代产品，与TDF相比临床剂量更低，而且肾毒性更小。长期研究表明，TDF可改善肝功能不全患者的肝功能，有助于肝纤维化的消退。因此，TAF和TDF也许能直接促进肝纤维化的消退，但相关的作用机制还知之甚少。

丙型肝炎病毒NS5反式调节蛋白9（NS5ATP9）在生物体内参与了多种功能，如细胞增殖、分化、凋亡以及DNA复制、损伤修复和信号转导等，在肿瘤的发生发展中也起了一定作用。以往的研究发现，NS5ATP9能够抑制肝星状细胞（HSC）的增殖并促进其凋亡。在阴道上皮细胞内，TDF诱导NS5ATP9表达的上调，但其作用和机理尚不清楚。

于是，研究人员此次探讨了TAF和TDF在治疗肝纤维化中的作用以及与NS5ATP9的关联。

TAF和TDF抑制小鼠的肝纤维化

在研究过程中，研究人员使用了四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝纤维化模型。对小鼠长期注射CCl4会诱发可逆性肝纤维化，该模型通常用于药物的筛选和评估。通过肝组织的H&E等染色以及免疫组化分析，他们发现TAF和TDF改善了CCl4诱导的肝细胞损伤。同时，这些药物显著降低了与ECM沉积有关的基因表达，如α-SMA、collagen I、collagen III和collagen V，表明肝纤维化改善。这些结果表明TAF和TDF减弱了CCl4诱导的小鼠肝纤维化（图1）。

图1. TAF和TDF减弱CCl4诱导的小鼠肝纤维化

之后，他们又以LX-2细胞为对象研究肝纤维化。LX-2细胞是人类肝星状细胞系，被认为是肝纤维化中ECM的主要来源。他们发现，TAF和TDF显著降低了与ECM沉积有关的基因表达。同时促进TGFβ1活化的HSC回到静息的HSC。此外，这些药物还加速了HSC的凋亡并减缓了HSC的增殖。这些结果表明，TAF和TDF可在体外调控HSC的分化、激活和增殖，从而减弱肝纤维化。

具体是通过哪种分子机制呢？研究人员随后开展了进一步的研究。由于TGFβ1/Smad3信号通路被认为是肝纤维化的重要驱动因素，而炎症又会大大加剧肝纤维化的发展，故他们选择TGFβ1/Smad3和NF-κB/ NLRP3炎性小体信号通路作为后续研究的靶点。

在CCl4诱导的肝纤维化组中，NLRP3、caspase-1、TNFα、IL-1β等蛋白的表达水平明显升高，而在TAF和TDF组中则降低。与CCl4组相比，TAF和TDF组中NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA表达也降低。此外，在LX-2细胞中，TAF和TDF显著抑制了LPS激活的NLRP3炎性小体和肝星状细胞（图2）。因此，TAF和TDF是通过TGFβ1/ Smad3和NF-κB/ NLRP3炎性小体信号通路参与了肝纤维化的发病。同时，两个信号通路之间存在互相调节。

图2. TAF和TDF通过降低肝脏炎症而减弱肝纤维化

NS5ATP9同样抑制小鼠的肝纤维化

研究人员委托赛业生物构建了NS5ATP9敲除（NS5ATP9-KO）小鼠。基因簇分析表明，与野生型小鼠相比，NS5ATP9-KO小鼠中大多数负责肝纤维化的基因都失调，表明NS5ATP9在肝纤维化中起关键作用。为了证实这个结果，他们接下来利用CCl4诱导的小鼠和TGFβ1激活的LX-2细胞开展分析。体内和体外研究都证实了NS5ATP9在肝纤维化中过表达。

之后，他们研究了NS5ATP9缺乏是否会加剧肝纤维化和肝损伤。H&E染色和免疫组化分析显示，与野生型小鼠相比，NS5ATP9缺乏导致ECM沉积水平显著升高，并且加剧了肝损伤。他们接着利用LX-2细胞开展体外实验，发现NS5ATP9过表达抑制TGFβ1/Smad3和NF-κB信号通路的活性，而NS5ATP9沉默后，它们的活性显著升高（图3）。

图3. NS5ATP9在体内和体外通过TGFβ1/Smad3和NF-κB信号通路减弱肝纤维化

如此看来，TAF、TDF和NS5ATP9都通过TGFβ1/Smad3和NF-κB信号通路抑制肝纤维化。那么TAF和TDF是不是通过NS5ATP9来组装TGFβ1/Smad3和NF-κB信号通路，从而减弱肝纤维化？研究人员发现，小鼠中注射TAF和TDF后，肝组织中有更多的NS5ATP9表达。在LX-2细胞中，NS5ATP9也以浓度依赖的方式被TAF和TDF调节。这些结果表明，TAF和TDF在体内和体外都上调了NS5ATP9的表达。

TAF和TDF通过NS5ATP9减弱肝纤维化

利用野生型小鼠和NS5ATP9-KO小鼠，研究人员来进一步证实这个假设。他们发现在敲除NS5ATP9后，TAF不能明显抑制纤维化肝脏中的ECM沉积。同样，CCl4诱导的α-SMA、collagen I、collagen III和collagen V高表达、TGFβ1/Smad3和NF-κB信号通路的激活以及肝纤维化的高评分都无法通过TAF改善。体外实验也证实，当NS5ATP9过表达时，TAF和TDF抑制LX-2细胞的活化，但在NS5ATP9沉默后，这种作用部分消失（图4）。

图4. TAF和TDF通过NS5ATP9减弱了小鼠和LX-2细胞中的肝纤维化

结论

总的来说，研究人员通过一系列实验证实，TAF和TDF通过上调NS5ATP9的表达来组装TGFβ1/Smad3和NF-κB信号通路，从而阻止肝纤维化的进展，并促使其逆转。TAF和TDF也调节了肝星状细胞的分化、激活和增殖。这些结果表明，NS5ATP9有望作为肝纤维化的治疗靶点，而TAF和TDF也许能作为有效的治疗方案。（生物通 余亮）

原文检索

Zhao, J., Han, M., Zhou, L. et al. TAF and TDF attenuate liver fibrosis through NS5ATP9, TGFβ1/Smad3, and NF-κB/NLRP3 inflammasome signaling pathways. Hepatol Int 14, 145–160 (2020). https://doi.org/10.1007/s12072-019-09997-6