大脑组织清除术技术综述（二）

哺乳动物的大脑由数十亿个神经元组成，这些神经元通过不同的电路连接在一起，每个神经元都参与特定的生理功能。为了更好地了解这些不同的神经元和电路是如何与精神活动和疾病联系在一起的，研究人员正在重建神经网络的详细的三维地图。

　　

2.软和硬组织同时清除法

开发者：德州农工大学的Hu Zhao团队

问题：现有的清除方案不能同时清除软组织，如脑和脊髓，以及钙化的硬组织，如骨。这使得想象中枢和外周神经系统之间完整的连接变得很困难，因为脊髓中的外周神经与脊椎相连，而且椎骨太不透明而无法成像。

方法：Zhao和他的团队开发了一种程序，他们将其命名为PEGASOS（聚乙二醇相关溶剂系统），以同时清除软组织和硬组织（Cell Rese，28:803–18，2018）。这一过程与其他清除方案类似，只是它使用聚乙二醇（PEG）增强荧光保存，并包含两个附加步骤：硬组织脱钙和有色组织（如肝脏）的脱色，因为肝脏含有高水平的铁，所以看起来是红色的。对于那些使用小身体部位的人，组织可以被动地浸入化学试剂中。或者，可以使用灌注泵在全身循环清洗溶液。

研究人员使用PEGASOS追踪大鼠脊柱两个不同节段之间的单个轴突，并在不通过手术将其与脊椎分离的情况下，观察脊髓内的神经元。他们还观察了骨髓中神经的三维分布，发现神经在某些骨区域的空间分布很丰富。

缺点：PEGASOS处理后，组织收缩30%到40%，这可能会扭曲组织结构。

用时：对于浸泡的软/硬组织，清理大约需要7到12天。全身清洁需要更长时间，因为清洗液必须循环10天，幼鼠的整个清除过程达到3周。对于组织较多的成年大鼠，循环过程的持续时间必须加倍。这将整个用时延长到一个月左右。

下一步是什么？对于所有类型的组织，组织收缩可能并不均匀。Zhao计划开发一种改进的PEGASOS化学配方来克服这一挑战。研究小组还计划减少人体蛋白质的自然荧光发射，这些蛋白质会在与组织收缩相关的数据中产生噪音。

小贴士：组织清除只是第一步，Zhao说，随后的成像和数据处理更具挑战性。他建议新用户从薄薄的组织切片开始，而不是整个器官来熟悉整个工作流程。这项技术有预配液；Zhao估计清理一整只鼠的大脑大约需要30美元。

3.放大清洗法

开发者：东京大学Hiroki Ueda团队

问题：大多数现有的大脑清理技术并不能使组织完全透明，这使得构建单细胞分辨率的大脑地图变得困难。

方法：在筛选了近1700种化学物质后，Ueda和他的同事开发了一种称为CUBIC-X的方法，用于放大清理后的脑组织（Nat Neurosci，21:625–372018）。他们将组织浸泡在通过化学筛选确定的亲水性试剂中，使大脑体积扩大约为最佳容积膨胀的10倍，因为此后组织可能变得脆弱。利用他们的研究方案，Ueda和他的同事们能够在不丢失任何细胞的情况下对1厘米厚的小鼠大脑进行成像。而且由于扩张的组织是99%的水，所以整个大脑各层的折射率基本保持不变。这使得组织变得透明，并允许近100%的光透射用于单细胞分辨率成像。

缺点：用于扩大组织的化学物质倾向于熄灭标记神经元和亚细胞成分（如RNA）的荧光信号。

用时：用CUBIC-X清除整个小鼠大脑的组织大约需要16天。

下一步是什么？未来，Ueda希望将CUBIC-X应用于其他器官，包括心脏和肺。他还计划利用这项技术清除大型哺乳动物的大脑，如非人灵长类和人类。

小贴士：研究人员创建了CUBIC图谱，这是一个带有单细胞注释的开放式小鼠大脑图谱。用户可以将他们的数据与图谱进行比较，以评估大脑清理的可重复性。CUBIC-X在商业上是可以买到的（每25毫升50美元，足够一个鼠的大脑）。

4.盾牌（SHIELD）保护法

开发者：麻省理工学院Kwanghun Chung团队

问题：在组织清理过程中，酶和化学物质被用来消化组织，去除脂质，有时还会使样本脱水。除了熄灭标记分子的荧光信号外，这些过程不可避免地降解了蛋白质和RNA，破坏了关键的分子信息。

方法：Chung和他的同事们利用一种叫做聚环氧化合物的材料来解决这个问题。环氧树脂在航空航天工业中被广泛用作胶水，为木材等较弱的材料提供结构支撑。在分子水平上，它有助于维持蛋白质结构。这一点很重要，因为蛋白质三维形状的微小变化会导致它失去荧光和结合能力。

研究小组筛选了六种类型的环氧化物，并通过计算模拟确定了一种最能保持绿色荧光蛋白（GFP）荧光的环氧化物。然后将环氧化合物注入小鼠的脑组织中进行基因修饰。在那里，环氧树脂与绿色荧光蛋白反应形成柔性化学键。这些键保护了GFP在组织清除过程中的变性，并允许GFP在组织清除后重新折叠回其自然构象。

Chung和他的同事们展示了他们称之为SHIELD（通过分子内环氧化物连接稳定到恶劣条件以防止降解）的技术，保持了荧光蛋白信号。它还保护了组织清除后蛋白质与抗体结合的能力，以及RNA转录物与RNA探针的能力（Nat Biotenol，37:73–83，2019）。研究小组将屏蔽和组织清除结合起来，用单细胞分辨率成像出2毫米厚的人脑和小鼠大脑片段。

用时：屏蔽组织治疗整个小鼠大脑大约需要4天。随后的组织清除需要额外的4到6天，总共两周。

下一步是什么？该研究小组计划将SHIELD应用于较大的器官甚至肿瘤上。他们还开发了一种改进的系统，以促进抗体穿透组织，从而更快地进行标记。

小贴士：由于环氧化物的处理，屏蔽处理过的组织更坚硬，抗体穿透速度较慢，因此整个小鼠大脑的抗体标记需要更长的两天时间。SHIELD可在Life Canvas Technologies公司购买。清理一只鼠的大脑16美元就足够了。