大脑组织清除术技术综述（一）

　　

哺乳动物的大脑由数十亿个神经元组成，这些神经元通过不同的电路连接在一起，每个神经元都参与特定的生理功能。为了更好地了解这些不同的神经元和电路是如何与精神活动和疾病联系在一起的，研究人员正在重建神经网络的详细的三维地图。

然而，哺乳动物大脑的三维成像具有挑战性。光在通过组织层时会散射，这些组织被水、脂类和蛋白质等各种分子分散。这会降低图像分辨率。

提高分辨率的一种方法是减少散射。研究人员首先去除组织中的水分和脂质，接下来，引入具有折射率的化学物质，折射率是指在蛋白质范围内，分子对通过它们的光的弯曲程度。在填充组织环境的分子中建立近乎均匀的折射率，可以使光线会聚以提高图像分辨率。这是大多数组织清除方法的工作原理，几十年来，这些方法已经成功地应用于骨等硬组织。

但是对脑组织清理，收效甚微，因为可用的化学物质对脆弱的神经组织过于苛刻。2013年，斯坦福大学的Karl Deisseroth和他的团队用一种叫做clearty的水凝胶技术彻底改变了这种方法。这项技术使研究人员能够用荧光标记标记标记小鼠神经组织中的神经元，然后在保存荧光信号的同时，对整个小鼠大脑进行成像，而无需对其进行切片。

从那时起，随着研究人员开发出能更好地保存组织结构和蛋白质结构的化学混合物，组织清除方法不断改进。最新技术也与荧光标签兼容。当它们与先进的组织处理方法（如自动细胞计数）相结合时，研究人员可以识别神经元甚至细胞内成分，精确度不断提高。

在这里，我们将着重介绍一些最近的创新，它们结合了新兴的组织清除技术和组织处理技术来实现大脑的高分辨率成像。

1.RTF脂质兼容清除法

开发者：中国华中科技大学Dan Zhu团队

问题：许多组织清除方法依赖于有机溶剂或清洁剂，这些溶剂或清洁剂会降解脂质细胞膜，以及通常用于染色神经元和细胞内细胞器的脂类染料。

方法：Zhu和她的团队开发了一种称为RTF（基于三乙醇胺和甲酰胺的快速清除方法）的组织清除方法，该方法与基于脂质的染料兼容（Sci Rep, 8:1964, 2018）。

RTF是一种含有水、甲酰胺和三乙醇胺的高折射率化学品的溶液。在一次偶然的意外中，另一个实验室发现，一种常用于分子生物学缓冲液中的化学物质甲酰胺可以清除组织。一些试验表明，甲酰胺很可能使蛋白质部分变性，降低其折射率，使其更接近水和脂类的折射率。这有助于创建折射率更均匀的环境。

研究小组发现，在用RTF清除小鼠大脑后，内源性蛋白质的荧光信号和一种被广泛用于染色轴突的脂基染料Dil并没有被抑制。

缺点：RTF不能清除超过1毫米厚的成年小鼠脑组织。此外，在清除的组织中还存在大约2%到5%的不希望的收缩，这会降低成像组织结构和神经网络的准确性。

用时：与其他费时一个礼拜的技术不同的是，RTF在经过一天的化学孵育后即可清除组织。这个过程也是可逆的：清除的组织可以通过浸泡在盐水中恢复到原来的状态。这对于长期储存很有用，因为被清除的组织本身会变得不太稳定。

下一步是什么？用抗体进行免疫染色可以让研究人员看到特定的细胞和蛋白质，但是组织的清除通常会减缓抗体进入组织的速度。Zhu正在研究一种加速抗体渗透到用RFT清除的脑组织中的方法，从而进一步减少组织处理时间。

小贴士：为了优化组织透明度，Zhu建议调整他们方案中列出的清除时间。虽然RTF不能在市场上买到，但试剂价格便宜，可以买原料自己配置。Zhu说，与其他大多数组织处理技术相比，清理的设备也更简单。