利用CRISPR-Cas13来分析斑马鱼胚胎中的基因功能

　　

美国和西班牙的研究人员近日开发出一种基于Cas13酶的CRISPR系统，能够系统并精准地敲低斑马鱼胚胎中的母体和合子mRNA，有助于概括发育表型，并分析胚胎中的基因功能。这项成果于8月7日发表在《Developmental Cell》杂志上。

尽管母体基因对早期发育程序的建立至关重要，但由于缺乏系统评估的技术，人们还无法研究它们在胚胎中的功能。此外，CRISPR-Cas13平台虽然已用于酵母、植物和哺乳动物细胞系中的RNA敲除，但尚未用于动物模型系统。

在这项研究中，研究人员利用一种称为RfxCas13d的Cas13同源物来开发出一种高效且精确的系统，能够降低斑马鱼胚胎中特定的mRNA转录本。他们利用它来靶向合子表达的转录本和母体提供的转录本，导致转录本水平下降了76%。他们还证明此系统可应用在青鳉、鳉鱼和小鼠胚胎中。

共同通讯作者、斯托尔斯医学研究所的Ariel Bazzini：“这项研究的激动人心之处不仅在于我们发现了什么，还在于我们可以做什么。基因如何启动早期阶段的发育，我们至今仍然不了解。母体对胚胎的贡献也是许多人想要解开的谜团。”

利用Cas13而不是Cas9，研究人员开发出靶向RNA而不是DNA的平台。他们还直接调控RNA活性，以此来研究转录水平的细微变化如何影响生物进程。此外，通过降低但不完全去除基因活性，他们还可以揭开致死基因的表型。而且，靶向RNA的治疗方法也更具优势，因为它们带来了暂时的修饰，而不是永久的变化。

研究人员首先测试了四种Cas13直系同源物。他们将每种Cas13变异体的mRNA分别注射到单细胞阶段的斑马鱼胚胎中。他们发现，RfxCas13d能够有效破坏母体和合子基因的功能，对斑马鱼胚胎具有特异性，但没有毒性。

为了弄清楚CRISPR-RfxCas13d系统是否可用来靶向母体提供的mRNA，他们选择了一些来源于转基因母亲的斑马鱼胚胎，其母亲高水平表达红色荧光蛋白（RFP）。他们向斑马鱼胚胎中注入了RfxCas13d mRNA、gfp mRNA，以及靶向rfp的三个向导RNA。

研究人员发现，与单独注射mCas13d或gRNA的胚胎相比，这些胚胎的荧光强度明显降低。此外，与单独注射mCas13d的胚胎相比，rfp的mRNA水平大约降低了4.4倍。这表明在斑马鱼胚胎发育的早期，CRISPR-RfxCas13d系统能够以特定的方式破坏母体提供的mRNA的活性。

他们接下来评估了斑马鱼胚胎中靶向基因敲低的有效性和特异性。为了评估内源基因敲低对全转录组的影响，他们以szrd1 mRNA作为研究对象。他们发现，与对照相比，注射CRISPR-RfxCas13d的斑马鱼胚胎中szrd1 mRNA表达水平降低了七倍，且其他mRNA没有发生实质性的变化。

研究人员认为，这些结果表明CRISPR-RfxCas13d系统是特异性的。后续的实验结果还表明，CRISPR-RfxCas13d有效敲低了母体和合子的mRNA，能够概括斑马鱼胚胎的早期胚胎发育表型，且毒性、应激和脱靶效应都极低。

作者认为，本研究所采用的技术可作为在体内实施CRISPR-Cas13应用的起点，例如在哺乳动物细胞中开展RNA编辑、转录本追踪和成像优化。（生物通 薄荷）

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CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos
DOI: https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.07.013