北京大学口腔医院团队解析罕见牙病背后的原因

　　

俗话说：“牙好，胃口就好，身体倍儿棒，吃嘛嘛香。”拥有一口健康的牙齿，不仅能给颜值加分，对身体健康也是至关重要的。不过，有些人先天患有“牛牙症”，顾名思义，即牙体增大，髓室异常大，延至根部，有些类似牛牙。

这种异常的牙齿结构早就引起了研究人员的注意。先前的研究发现，WNT10A在牙齿发育中扮演了重要角色。带有WNT10A双等位基因突变的患者以及缺乏WNT10A的小鼠均出现牛牙症。最近，北京大学口腔医院的研究人员深入探索了WNT10A在牙根发育中的作用，并将结果发表在《Journal of Dental Research》杂志上。

文章的通讯作者为北京大学口腔医院口腔修复科的韩冬。她领导的团队在文中写道：“我们的研究提供了第一个体内证据，证明上皮Wnt10a指导了根分叉形成，并在根分叉形态发生过程中通过调控适当的Wnt4表达而在控制相邻间充质细胞的有序增殖中发挥关键作用。”

背景

牙根的重要性不言而喻，因为它可以将牙齿锚定在颌骨上。臼齿有多个根，中间有分叉，可在咀嚼过程中将咬合力传递到牙槽骨上。牙根缺失以及大小和形状的缺陷会导致牙槽骨支撑减少，以及牙齿功能受到干扰。因此，了解牙根发育过程和调控机制是研究牙根的前提条件。

牙根的发育是一个复杂的过程，受到牙内上皮与间充质之间相互作用的调控。几种高度保守的信号通路介导了牙根发育期间的上皮-间充质相互作用，包括TGF-β、hedgehog和Wnt/β- catenin信号通路。作为Wnt/β- catenin通路中的配体，WNT10A突变在人类牙齿发育中起着主要的致病作用。这个团队之前发现带有WNT10A双等位基因突变的患者以及缺乏WNT10A的小鼠均出现牛牙畸形，表明Wnt10a在牙根形态发生中起重要作用。

在牙齿发育的整个过程中，上皮和间充质中均可观察到Wnt10a的表达。然而，在牙根发育期间，Wnt10a是在上皮细胞还是上皮根鞘（HERS）细胞中表达，之前没有仔细观察或提及。尽管有大量的证据显示Wnt10a与牙根形态发生有着很强的关联，但目前不清楚是上皮还是间充质Wnt10a控制根分叉开始，而Wnt10a在调控牙根形态发生中的功能意义也未经证实。

上皮Wnt10a指导了根分叉

在这项研究中，研究人员对小鼠全身、牙齿上皮和牙齿间充质中的Wnt10a基因进行条件性敲除来建立小鼠模型，并研究下颌臼齿的根部形态，从而探索Wnt10a在牙根发育中的作用。他们委托赛业生物制备了Wnt10a^flox/flox小鼠，然后将其分别与EIIa-Cre、K14-Cre和Wnt1-Cre小鼠杂交，产生不同的条件性敲除小鼠。通过微计算机断层扫描分析，他们发现全身敲除小鼠EIIa-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠和上皮敲除小鼠K14-Cre;Wnt10a^flox/flox缺乏根分叉或分叉位置位于根尖部，并具有较大的牙髓腔，而间充质敲除小鼠Wnt1--Cre;Wnt10a^flox/flox的根分叉几乎不受影响（图1）。因此，上皮Wnt10a而不是间充质Wnt10a对根分叉的正确形成很关键。

图1. Wnt10a敲除小鼠和对照小鼠的微计算机断层扫描分析

上皮Wnt10a的敲除有何影响？

为了进一步了解上皮Wnt10a在根分叉发育过程中的作用，研究人员在Wnt10a^flox/flox小鼠和K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠的关键发育时间点对下颌第一磨牙进行苏木精-伊红染色。在出生后第4天（PN4），Wnt10a^flox/flox小鼠的牙冠已长到完整大小，上皮根鞘已形成。然而，对于K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠，上皮从颊侧和舌侧向中心生长的阻滞很明显，且未观察到上皮的水平延伸。到了PN7和PN14期，两组之间的形态差异更明显。在PN28期，Wnt10a^flox/flox小鼠的下颌第一磨牙已形成典型的根分叉，而K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠的根分叉在根尖且不明显。这些数据表明，牙齿上皮中Wnt10a的缺失导致牛牙畸形并破坏根分叉形态发生。

为了证明Wnt10a在牙根发育中的功能意义，研究人员又开展了RNAscope分析，以观察Wnt10a在发育阶段的表达模式。在胚胎发育18.5天（E18.5），Wnt10a mRNA在牙冠的上皮和间充质中表达。在出生后第2天（PN2），也就是HERS出现之前，Wnt10a在牙颈部区域的上皮细胞及相邻的间充质细胞中表达。在PN6期，当HERS向牙齿中部水平延伸时，Wnt10a在HERS及相邻的牙乳头细胞中表达。到了PN9期，当牙髓腔底部形成时，Wnt10a的表达集中在根分叉处的成牙质细胞和周围的牙囊细胞，但在上皮细胞中几乎检测不到。这种动态表达模式表明Wnt10a可能在根分叉发育过程中发挥独特的作用。

之后，他们又开展了细胞增殖和凋亡分析，以了解K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠出现牛牙症的细胞机制。他们的研究对象是E-钙粘蛋白，这是一种上皮细胞粘附标志物，可用来区分牙齿间充质和上皮。在PN0期，他们发现与Wnt10a^flox/flox小鼠相比，K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠根分叉区域的牙齿上皮细胞的增殖明显减少（图2）。在PN4和PN7期，K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠根分叉区域的牙乳头间充质细胞的增殖明显增加。这些数据表明，上皮Wnt10a在牙根发育的过程中调控了分叉区域的上皮细胞和间充质细胞的有序增殖。

图2. Wnt10a在牙根发育期间的表达模式以及K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠牙上皮和间充质细胞的表达改变

Wnt配体对于牙齿发育过程中的细胞增殖至关重要。因此，研究人员假设，其他Wnt配体可能被上调以补偿上皮Wnt10a的损失。为了检验这个假设，他们对PN4的Wnt10a^flox/flox和K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠的下颌第一臼齿开展了RNA测序分析。结果表明，Wnt10a敲除后Wnt4的表达明显增加。同时，RNAscope分析也证实，在K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠臼齿中，根分叉区域的牙乳头间充质细胞中的Wnt4和Axin2表达增加。

Wnt4的沉默部分拯救了牛牙缺陷

为了检验牙乳头间充质细胞中的Wnt4控制根分叉形态发生的假设，他们在PN4小鼠臼齿和肾囊移植中通过腺病毒介导的Wnt4敲低开展拯救实验。微计算机断层扫描的结果显示，在感染了Wnt4-shRNA的K14-Cre;Wnt10a^flox/flox臼齿中，肾囊移植后出现了类似于根分叉的峡部（图3）。具体来说，牙根的正常根尖生长不受干扰，而根的轴向轮廓从椭圆形变为花生形。这些结果表明，腺病毒介导的Wnt4的敲低部分拯救了K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠的牛牙畸形。

图3. Wnt4的补偿性上调促进了K14-Cre;Wnt10a^flox/flox小鼠的牙髓增殖和牛牙症

这项研究首次提供了体内证据，表明上皮Wnt10a指导根分叉的形成。作者认为：“对Wnt10a驱动的上皮-间充质相互作用的了解将大大促进我们对正常和异常牙根发育的的分子和细胞机制的认识。这项研究的信息有望促进生物工程的牙根再生。”（生物通 余亮）

原文检索

Yu M, Liu Y,et al. Epithelial Wnt10a Is Essential for Tooth Root Furcation Morphogenesis. J Dent Res. 2020 Mar;99(3):311-319. doi: 10.1177/0022034519897607.