苏州大学Nature子刊发文：线性泛素化调控IFN抗病毒信号的新机制

　　

近年来，蛋白质泛素化成为基因表达调控研究的热点，泛素化在各类细胞信号通路中发挥重要的调节作用。泛素分子通常含有7种内部赖氨酸残基，通过这些残基可与其他泛素分子的甘氨酸C端相连产生分支，形成多聚泛素化修饰。

最近又鉴定了一种新的多聚泛素链——线性泛素链，由两个泛素N、C端首尾相接而成。已有研究鉴定线性泛素化是由线性泛素化复合体(LUBAC)作为泛素连接酶特异性诱导，该复合体由血红素氧化IRP2泛素连接酶(HOIL-1L)、HOIL-1L互作蛋白(RNF31/HOIP)和SHANK相关域互作蛋白(SHARPIN)组成，同时去泛素化由线性连接特异的OTU去泛素化酶(OTULIN)介导。LUBAC/OTULIN广泛参与NF-kB、IFN、NLRP3、TRIM25等天然免疫相关蛋白的调控，但是具体的机制还未知。

近期，来自苏州大学生物医学研究院郑慧教授团队发表了题为“Regulation of the linear ubiquitination of STAT1 controls antiviral interferon signaling” 的研究论文，鉴定了线性泛素化修饰的一个新的底物，并首次揭示了蛋白线性泛素化修饰对干扰素（IFN）抗病毒信号的关键调控机制。

郑慧教授团队经过近几年的深入研究，发现转录因子STAT1在静息细胞中存在强烈的线性泛素化修饰，并通过一系列实验证实了STAT1是一个新的线性泛素化修饰的蛋白底物。

这一发现公布在Nature Communications杂志上。

最近的进展揭示了线性泛素化修饰的三个调控机制：
（1）促进信号蛋白的活化；
（2）促进特异性信号蛋白的募集；
（3）促进底物蛋白的降解。

在该研究中，郑慧教授团队揭示了线性泛素化修饰的另一个调控机制：线性泛素化修饰抑制转录因子与其上游信号的相互作用。该研究表明，STAT1线性泛素化修饰阻止了转录因子STAT1与IFN受体IFNAR2的结合，从而抑制了STAT1的磷酸化和活化，维持了细胞内IFN信号的稳态。这种对转录因子的内在负调控不同于NF-κB的抑制——转录因子NF-κB在细胞中存在一个内在负调控因子IκB蛋白，而STAT1并未发现这样一个内在负调控蛋白。线性泛素化负调控转录因子的活化，可能为理解转录因子在细胞内如何保持稳态提供了新思路。这种调控作用对于控制IFN过度活化、避免自身免疫疾病也具有重要意义。

研究者重点关注了信号转导与转录激活因子1(STAT1)，那么STAT1是否受线性泛素化调节，进而影响干扰素IFN表达呢？

质谱分析显示了HOIP与STAT1的相关性，通过免疫沉淀、免疫荧光证实了两蛋白质间的相互作用，缺失实验进一步说明了作用位点在TAD结构域，而且该相互作用是组成性的，表明线性泛素化参与STAT1的表达调节。基于上述推断，研究者在细胞中观察到内源性STAT1具有依赖于HOIP的强泛素化修饰，敲低HOIP将导致显著抑制内源和外源STAT1。LUBAC能够显著增强总泛素化和线性泛素化，而对E3泛素连接酶突变将失去增强作用。研究者进而构建了HOIP敲除细胞，发现细胞内STAT1完全无法线性泛素化。

接着，研究人员试图探究线性泛素化的生物学意义，实验表明LUBAC/HOIP并非通过影响STAT1的mRNA、蛋白质水平，LUBAC介导的STAT1活化抑制主要依赖于HOIP的E3连接酶活性。LUBAC过表达显著抑制了IFN-I诱导的STAT1激活，抑制ISG表达；敲除HOIP则促进IFN诱导ISRE启动子活性，进而增强IFN-α和IFN-β诱导ISG mRNA、蛋白表达，尤其是在RNA病毒、DNA病毒侵染时抗病毒活性显著增强。因此线性泛素化对STAT1介导的天然免疫起到限制作用。为了进一步探究线性泛素化是否会影响自分泌IFN，研究者过表达LUBAC对干扰素产生无明显影响，但是敲除HOIP在无外加干扰素的条件下也能激活STAT1，并上调ISG水平，显著增强抗病毒能力，在STAT1缺失的细胞中就无增强作用，因此线性泛素化调控的抗病毒效果依赖于STAT1。综合以上实验，可以认为线性泛素化起到维持IFN信号稳态的作用。

研究人员进而分析STAT1对IFN下游信号的具体调控机制，HOIP敲除或LUBAC过表达对于IFN下游其他蛋白质无影响，仅作用于STAT1通路。通过生物信息学分析结合质谱技术，鉴定出了STAT1的7个赖氨酸泛素化位点，通过氨基酸突变实验证实Lys511、Lys652为线性泛素化位点，能够抑制IFN抗病毒应答。研究者发现HOIP敲除影响胞质STAT1磷酸化水平，线性泛素化可能在STAT1入核之前发挥作用。突变磷酸化位点不影响LUBAC结合更加证明线性泛素化先于磷酸化。IFN诱导信号通路中JAK1结合IFNAR2，招募并磷酸化激活STAT1，线性泛素化可能直接作用于JAK1-STAT1，利用敲除、过表达、突变实验直接证明了线性泛素化抑制JAK1/STAT1结合及IFNAR2招募结合STAT1的过程。说明 Lys511、Lys652的线性泛素化直接阻断了IFNAR2结合。为了探究IFN如何激活STAT1，IFN诱导磷酸化的STAT1没有泛素化，因此推测IFN诱导能够除去STAT1线性泛素化，OTULIN可能与STAT1作用促进该过程。过表达或敲除OTULIN显著影响了线性泛素化，外加IFN可增强OUTLIN与STAT1的结合，因此说明IFN激活STAT1由OTULIN介导。基于之前的结论，过表达或敲除实验也证明OTULIN增强STAT1与IFNAR2结合。

研究人员探究了该机制在抗病毒中的作用。利用仙台病毒(SeV)、水疱性口炎病毒(VSV)侵染细胞，发现在感染较长时间后病毒诱导HOIP表达升高，并促进HOIP与STAT1结合，促进线性泛素化，负调节IFN信号通路。说明线性泛素化与磷酸化共同参与抗病毒应答。研究者在小鼠模型中进一步探究，HOIL-1L杂合小鼠具有更强的IFN应答，STAT1高度活化，病毒显著减少。嵌合小鼠模型表明突变泛素化位点增强抗病毒反应。因此线性泛素化对调节天然免疫与抗病反应发挥重要作用。

这项研究不仅揭示了线性泛素化的一种新的生物学调控，为经典的干扰素途径提供了更加完整的框架，而且靶向LUBAC可能提高基于干扰素的抗病毒治疗效果。

原文标题：

Regulation of the linear ubiquitination of STAT1 controls antiviral interferon signaling