MMI激光显微切割技术助力不同亚型细胞突起的微蛋白质组学

细胞突起（Cellular protrusions）是参与细胞迁移和侵袭过程的高度动态结构。一个细胞要迁移，它的前缘必须形成突起，然后附着或收缩。在许多病理过程中，如癌细胞的迁移和侵袭，都受到不同亚型细胞突起的控制，如伪足、丝状伪足、生长锥(GCs)或隧道化纳米管(TNTs)。因此，研究不同类型突起的结构、组成和功能，有助于揭示癌症转移的潜在机制，寻找治疗靶标。

微蛋白质组学是从复杂但是微尺度的样品中鉴定蛋白质，研究其结构、组成和功能的技术，是研究细胞突起的理想工具。然而，由于没有技术可以明确地分离出不同亚型的突起，该方向的研究一直受阻。

近期，加州州立大学弗雷斯诺分校的Karine Gousset教授等人描述了一种利用MMI激光捕获显微切割 (LCM)技术从诱导分化的CAD细胞中成功分离高纯度、高特异性的亚细胞突起的方法。结合Orbitrap高分辨质谱，鉴定并首次确认了不同亚细胞突起拥有显著不同的蛋白质组特征。

今天，小编就带大家围观这波高精尖的神操作~

首先，各位看官，咱们先了解今天要“受刑”的这位CAD细胞，该细胞拥有原代神经元的特征，是神经元分化研究的独特工具。CAD的分化能够通过无血清饥饿培养诱导（dCAD），产生容易识别的细胞突起；加入过氧化氢处理的CAD(hCAD),能够增加丝状伪足和TNT、GCs的数量。为了获得足量的蛋白，作者利用LCM从5000~6000次切割中收集hCAD的GC样本，从~1000次切割中收集hCAD的丝状伪足样本，从~1000-2000次切割中收集dCAD的突起样本（轴突和树突），从~12000次切割中收集hCAD的TNT样本，并收集3ug的全细胞作为对照。上图~~~

LCM切割dCAD(20X)。I. 切割前的圈选，II.激光显微切割过程产生的极细切割线 III.切割后的轴突和树突。轴突上箭头处为丝状伪足。

LCM切割hCAD(40X)中各类型突起

LCM切割hCAD(40X)中生长锥结构（GCs）

LCM切割hCAD(40X)中丝状伪足

LCM切割hCAD(60X)中隧道化纳米管(TNTs)

将采集的dCAD突起和hCAD突起各自分成两组，GCs分成3组，TNTs一组，经质谱检测，每组均鉴定到几百个unique protein。其中，dCAD突起、hCAD突起和GCs在两组中共同鉴定到的Unique protein都超过一百个。

接下来，作者对结果的准确性及重复性进行一系列验证实验。

首先，作者使用SuperExactTest软件评估对照组（全细胞）和三组特异突起的unique protein的交集度和相关性。结果显示每组细胞突起都表现出高度的蛋白重叠，且对照组和检测组高度相关，说明LCM分离的微量细胞突起样本能够满足数据的准确度和重复性要求。

然后，挑出GCs的数据，将其与基于大样本方法得到的GCs的蛋白质组和转录组信息数据库进行比对。发现其鉴定得到的unique protien和数据库中的信息高度相关。进一步证实了建立在微量样本采集之上的LCM/MS系统的准确性和高度重复性。并且，在两组样本都鉴定到的193个unique protein中, 仅有11.4%没有在数据库中找到，后通过文献检索，*终证实其中仅有1%的蛋白没有足够的数据表明其GC定位或功能，而其他均与GC相关或功能一致。显示了LCM/MS方法的准确性以及用于鉴定新蛋白的潜力。

 

同时，利用免疫荧光（IF）确定LCM/MS鉴定到的蛋白是否真实存在。从已知功能和定位信息的蛋白中，挑选四个被期望出现在细胞突起的蛋白（Cd47, Anxa2, Tenm2,Cobl）和4个不被期望出现的蛋白(Grk5，Hist1h3b, Hspa1b, Arg1)。IF结果显示四个被认为应当出现在细胞突起的蛋白均在不同的突起物中被鉴定到。而四个LCM/MS鉴定出的但形态学尚未证实的蛋白，也分别在*初分离的突起物中被IF观察到明亮的斑点信号。总之，此8个LCM/MS鉴定到的蛋白，均在不同的突起中被IF实验检测到存在，证实了该方法的准确性。

当作者采用subtractive的方法重新分析采集的数据时， GO注释的结果显示使用LCM/MS从8个样品鉴定到的每组unique protein的前50个注释多数都与细胞突起的功能、定位高度相关，也说明该方法的准确性和特异性。

有趣的是，进一步的富集分析，除了验证了LCM/MS系统的特异性、准确性，还带来对不同细胞突起蛋白组的新的信息。

每个样本中发现的unique protein hits百分比的图表表明，分析的每种突起样本都包含许多独特的蛋白。其中，TNTs被发现拥有*独特的蛋白质组，74%的蛋白质命中是TNTs独有的。各组间的差异和TNTs观察到的**性进一步证明了 LCM/MS的特异性，并首次表明在蛋白水平上细胞突起存在明显的区别。

使用Functional Interpretation of Differential Expression Analysis (FIDEA) 分析的富集词云结果和Proteomaps的结果也证实了每种突起亚型的蛋白组功能上的独特性。同时，使用独立开发的COMPleat (COMPutational Localization Enrichment Analysis Tool)软件，对亚细胞定位富集分析的结果也显示每种细胞突起的蛋白组在定位上的差异。

要强调的是，作者在文章*后介绍了LCM的通用性。指出LCM的应用并不限于细胞形态，通过荧光标记，结合荧光显微镜能够分离到任何感兴趣的部位。作者目前正在从转染的CAD细胞中分离GFP-Myo10肌细胞依赖性的丝状伪足(下图)，通过MS鉴定其关键成分。

Gousset, K., Gordon, A., Kumar Kannan, S., & Tovar, J. (2019). A novel Microproteomic Approach Using Laser Capture Microdissection to Study Cellular Protrusions. International journal of molecular sciences, 20(5), 1172. 

*后是小编放彩蛋的时候啦！想知道文章中所使用到的LCM系统是哪一款吗？细心的小伙伴就会发现哦，就是来自德国MMI公司的 CellCut激光显微切割系统。该系统支持组织切片、贴壁培养细胞、染色体等切割。由于切割精准，操作友好，样品收集效率高等技术优势明显，受到众多使用者青睐，被许多顶级实验室所认可呢！

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