哈尔滨医科大学团队进一步解析lncRNA在心肌梗死中的作用

心肌梗死（MI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，常危及生命。据统计，我国每年发生急性心肌梗死的患者大约为100万人，而且25岁以上人群发病率逐步上升，特别是35-44岁人群的发病率上升幅度最大。因此，寻找心肌梗死的新治疗靶点具有重要意义。

近日，哈尔滨医科大学的研究人员进一步阐明了长链非编码RNA—ZFAS1在心肌梗死发病中的作用。这项研究成果有望帮助人们开发出心肌梗死的新型治疗策略，保护心肌细胞免受线粒体介导的凋亡。这篇题为“lncRNA-ZFAS1 induces mitochondria-mediated apoptosis by causing cytosolic Ca2+ overload in myocardial infarction mice model”的文章于2019年12月发表在《Cell Death & Disease》杂志上。哈尔滨医科大学的张莹和张勇为共同通讯作者。

心肌梗死的发病机制涉及到多种状况，而心肌细胞凋亡是最关键的部分。线粒体介导的凋亡通路（也就是内在通路）在心肌细胞的凋亡中起重要作用。近期的研究证实，细胞内钙超载可诱导线粒体介导的凋亡。不过，在心肌梗死期间，钙超载如何诱导心肌细胞凋亡还不清楚。

长链非编码RNA（lncRNA）广泛参与了细胞代谢、信号传导、增殖、分化、凋亡和死亡等重要过程，对心血管疾病的发生发展具有重要意义。哈尔滨医科大学的研究团队之前发现，lncRNA—ZFAS1可作为急性心肌梗死的生物标志物。此外，他们还发现ZFAS1能够抑制SERCA2a蛋白的活性，并减弱心肌的收缩功能。那么，ZFAS1是否通过钙超载来参与线粒体介导的心肌细胞凋亡呢？这个问题仍有待回答。

在这项最新的研究中，研究人员利用心肌梗死小鼠模型，通过功能缺失和功能获得的方法来进一步阐述ZFAS1在线粒体介导的心肌细胞凋亡中的作用。

ZFAS1的敲低抑制心肌细胞凋亡

研究人员通过手术造模建立了心肌梗死的小鼠模型，并确认MI小鼠的心脏功能明显下降。他们接着采用功能缺失（loss-of-function）策略，利用病毒介导的ZFAS1-shRNA（shZFAS1-V）对ZFAS1进行敲低，发现这几乎消除了心肌梗死引起的线粒体肿胀和肌原纤维断裂。同样地，他们还利用siZFAS1在新生小鼠心肌细胞（NMCM）中开展实验，发现ZFAS1敲低可恢复经过低氧处理的心肌细胞的活力。

为了进一步评估ZFAS1对线粒体的影响，他们开展JC-1分析以评估细胞凋亡过程中线粒体膜电位的损失。结果表明，转染siZFAS1的细胞表现出绿色荧光的减少，表明这些细胞可能对低氧诱导的心肌细胞凋亡具有抗性。之后的TUNEL检测和Annexin V/PI双重染色结果也表明，用siZFAS1转染后，凋亡细胞的数量显著下降。这些结果表明，ZFAS1的敲低可保护心肌细胞免受凋亡（图1）。在分子水平上，心肌梗死小鼠心脏中促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9和Bax蛋白的表达显著增加，而抑凋亡蛋白Bcl2的表达则降低。不过，shZFAS1-V逆转了这些蛋白的异常表达。

图1. ZFAS1的敲低抑制了由心肌梗死引起的心肌细胞凋亡。

ZFAS1的过表达诱导心肌细胞凋亡

既然ZFAS1敲低可保护心肌细胞免受凋亡，那么ZFAS1在正常小鼠和NMCM中的过表达应该能够重复心肌梗死的表型和低氧诱导的细胞凋亡。为了验证这一假设，研究人员在后续实验中采用了功能获得（gain-of-function）方法。他们构建了携带ZFAS1基因的AAV载体（ZFAS1-V）用于体内条件下的过表达，并将pCDNA-ZFAS1载体（ZFAS1-P）转染到NMCM内，用于体外条件下的过表达。

与ZFAS1沉默形成鲜明对比的是，通过尾静脉注射ZFAS1-V会引起线粒体肿胀，在蛋白质水平上会导致caspase-3、caspase-9和Bax的表达升高以及Bcl2的表达下降。在细胞水平上，ZFAS1-P转染的NMCM表现出细胞活力受损，TUNEL分析表明ZFAS1过表达引起心肌细胞凋亡。在亚细胞水平上，转染后的NMCM表现出Bcl2蛋白的下调和Bax蛋白的上调（图2）。

图2. ZFAS1在健康小鼠中的过表达诱导凋亡。

ZFAS1通过抑制SERCA2a和引起钙超载而诱导心肌细胞凋亡

为了进一步研究ZFAS1在心肌梗死中的作用，研究人员委托赛业生物构建了心脏特异性的ZFAS1敲入（TG）小鼠，构建过程如图3。这些小鼠表现出心脏功能受损和钙稳态失衡，且SERCA2a的表达和活性受到抑制。与对照组相比，ZFAS1敲入小鼠的心脏组织中的凋亡相关蛋白caspase-9和 caspase-3显著增加，而Bcl2降低。总的来说，SERCA2a的下调和功能失调诱导了ZFAS1-TG中的心肌细胞凋亡。

BAPTA是一种钙螯合剂，可以降低细胞内游离钙浓度，减轻或消除钙超载的作用。研究人员发现，BAPTA预处理能够有效地逆转ZFAS1诱导的细胞损伤。在分子水平上，BAPTA能够抑制ZFAS1过表达介导的Bax、caspase-3和capase-9的上调。值得注意的是，ZFAS1的功能域ZFAS1-FD也模拟了全长ZFAS1在调节心肌细胞凋亡中的作用。

图3. ZFAS1敲入小鼠的心脏功能受损且凋亡增加。

结语

作者认为，这些结果及以往的其他结果表明，lncRNA-ZFAS1在心肌梗死的发生中起着重要作用。通过抑制SERCA2a，ZFAS1不仅导致心脏损伤，还会导致心肌细胞凋亡。同时，ZFAS1的敲低显示出对缺血性心肌和低氧心肌细胞的保护作用。“这项研究进一步证实了ZFAS1有望作为治疗心肌梗死的潜在靶点，”他们写道。

（生物通 余亮）

原文检索

Jiao, L., Li, M., Shao, Y. et al. lncRNA-ZFAS1 induces mitochondria-mediated apoptosis by causing cytosolic Ca2+ overload in myocardial infarction mice model. Cell Death Dis 10, 942 (2019). https://doi.org/10.1038/s41419-019-2136-6