新型冠状病毒的基因组测序结果登上柳叶刀杂志

【字体: 时间:2020年02月01日 来源:生物通

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  为了弄清新型冠状病毒的起源,中国疾控中心、山东第一医科大学等机构的研究人员近日对9例住院患者的样本进行高通量测序,获得了完整和部分的2019-nCoV基因组序列。

  

2019年12月下旬,武汉出现了多例不明原因的病毒性肺炎病例。之后,中国疾病预防控制中心确定此次致病的病原体为一种新的冠状病毒。1月12日,世界卫生组织将其命名为“2019新型冠状病毒(2019-nCoV)”。截至2020年1月31日24时,中国31个省(自治区、直辖市)累计报告确诊病例11791例,疑似病例17988例。

为了弄清新型冠状病毒的起源,中国疾控中心、山东第一医科大学等机构的研究人员近日对9例住院患者的样本进行高通量测序,获得了完整和部分的2019-nCoV基因组序列。他们发现,这种新型冠状病毒在遗传学上与SARS和MERS冠状病毒不同,但与两种蝙蝠来源的冠状病毒密切相关。新病毒可能是最近才出现的,并采用与SARS相同的分子通道进入人体。

这篇题为“Genomic characterization and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding”的论文于1月29日在线发表于《柳叶刀》杂志上。

研究策略

在这项研究中,研究人员利用新一代测序和纳米孔测序技术,对9例住院患者(其中8人曾到过武汉华南海鲜市场)的支气管肺泡灌洗液(BALF)样本和培养分离株进行测序。他们从这些患者身上分别获得了完整和部分的2019-nCoV基因组序列。之后利用Sanger测序连接病毒重叠群,获得全长基因组,并通过RACE技术测定末端区域。

表1. 2019-nCoV 感染患者的样本信息

他们接着对这些2019-nCoV基因组和其他冠状病毒的基因组开展系统进化分析,以便确定这些病毒的进化史,帮助推断其可能的来源。此外,他们还通过同源建模来探索病毒可能的受体结合特性。

除了将样本送去华大基因测序,中国疾控中心的研究人员也通过Sanger,Illumina和Oxford纳米孔组合测序,从六个样品(WH19001、WH19005、WH19002、WH19004、WH19008和YS8011)中获得了2019-nCoV的全基因组序列。考虑到大家比较感兴趣,这里具体说一下他们的测序策略。

他们首先利用QIAamp Viral RNA Mini Kit直接从临床样品中提取病毒RNA,然后利用SuperScript III逆转录酶(ThermoFisher)和N6随机引物合成cDNA,再用DNA聚合酶I,Large (Klenow) Fragment(ThermoFisher)进行第二链合成。病毒cDNA文库制备使用的是Nextera XT Library Prep Kit(Illumina),之后利用Agencourt AMPure XP(Bechman Coulter)进行磁珠纯化,再用Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer进行定量。在Illumina的MiSeq或iSeq平台上对制备好的DNA文库进行测序,使用300-cycle的核心测序试剂盒。每个样本获得的数据量为1.2~5 GB。

研究人员利用先前描述的标准(J Infect 2016; 72: 52-59)来过滤每个病毒样本的原始fastQ文件,然后利用CLCBio软件11.0.1版本进行de novo组装。他们还使用蝙蝠来源的SARS样冠状病毒分离株bat-SL-CoVZC45(登记号MG772933.1)作为参照完成组装。之后利用CLCBio软件进行变异检出,基因组比对和序列注释,并通过Sanger测序确认组装的基因组序列。

最后,他们利用Invitrogen 5' RACE系统和3' RACE系统(Invitrogen)对cDNA末端(RACE)进行了快速扩增,以获得5'和3'末端的序列。他们设计了基因特异性引物,从两个区域获得大约400-500 bp的片段。之后将纯化的PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector(TaKaRa)和化学感受态的大肠杆菌(DH5α细胞;TaKaRa)中,并利用M13正向和反向引物对PCR产物进行测序。

序列比对

研究人员发现,从上述9例患者中获得的2019-nCoV基因组序列极其相似,序列同源性达99.98%,表明这种病毒是最近出现在人群中的。值得注意的是,2019-nCoV与2018年在中国东部舟山发现的两种蝙蝠相关冠状病毒ZC45和ZXC21密切相关,同源性约为88%。相比之下,2019-nCoV与SARS-CoV和MERS-CoV的亲缘关系更远,同源性分别为79%和50%。

他们通过系统进化分析发现,2019-nCoV属于β冠状病毒(Betacoronavirus)属的Sarbecovirus亚属,分支长度比蝙蝠来源的冠状病毒(ZC45和ZXC21)更长,在遗传学上与SARS-CoV截然不同(图1)。此外,同源性建模结果显示,2019-nCoV与SARS-CoV受体结合结构域的结构相似,只是在一些关键位点存在氨基酸变异,这意味着新型冠状病毒采用与SARS相同的ACE2受体进入人体,但其结合效能仍有待测试。(图2)

研究人员在文中指出:“令人惊讶的是,此处描述的不同患者的2019-nCoV序列几乎相同。这一结果表明,2019-nCoV在很短的时间内起源于同一个来源,并且迅速地检测到。随着病毒传播给更多个体,我们需要不断监控突变的发生。”

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图1. 2019-nCoV及β冠状病毒属代表性病毒的系统进化分析。(图片来自原文)


图2. 2019-nCoV、SARS-CoV和MERS-CoV的受体结合结构域的系统进化分析和同源性建模。(图片来自原文)

病毒起源

至于大家关心的病毒起源,研究人员认为,新型冠状病毒很可能来自蝙蝠,但通过华南海鲜市场上出售的一种野生动物传播给人类,这种中间宿主暂时未知。

此外,他们认为,与2019-nCoV相比,蝙蝠冠状病毒的重组事件更为复杂,且更可能发生,这意味着这种病毒不太可能是因为偶然的突变而出现的。尽管如此,还需要进一步的研究和更多的信息来确定病毒的确切来源以及它如何从动物传播到人类。

文章指出,新型冠状病毒病例的首次激增始于2019年12月下旬,当时武汉的大多数蝙蝠物种都在冬眠。而且,在疫情爆发之前,华南海鲜市场上并没有出售或发现蝙蝠,而是出售许多哺乳动物及其他非水生动物。

文中还提到,新型冠状病毒与蝙蝠来源的冠状病毒之间的序列相似性不到90%,这意味着蝙蝠冠状病毒不是新型冠状病毒的直接祖先。对于以往的SARS和MERS疫情,蝙蝠都是天然的宿主,而另一种动物充当中间的宿主。总的来说,此次疫情爆发再次凸显了野生动物体内隐藏的病毒库以及对人类的潜在威胁。

原文检索

Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding

https://www.thelancet.com/pb-assets/Lancet/pdfs/S0140673620302518.pdf

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