打破限制，CRISPR标记方法实现将任何功能编程到任何细胞类型中

　　

杜克大学的生物医学工程师团队创造了一种新方法，可以通过掌握基因调控网络的语言将干细胞转变为所需的细胞类型。

这一成果公布在Cell Reports杂志上，这种方法可以制造成熟的成年神经元，可用于编程任何细胞类型。

将干细胞编程为其他细胞类型并不是一个新概念，之前科学家们已经研发了几种方法，但是结果还有一些不足之处。在实验室中培养时，程序化的干细胞通常无法正确成熟，因此寻找成年神经元细胞进行实验的研究人员可能最终会得到胚胎神经元，而胚胎神经元无法模拟迟发性精神病和神经退行性疾病。

杜克大学博士Josh Black说：“乍一看，这些细胞似乎是正确的。但它们经常缺少您想要的细胞一些关键特性。”

CRISPR技术最常用于编辑DNA序列，称为“基因组编辑剪刀”，其中Cas9蛋白与导向RNA结合，引导Cas9在特定位置切割DNA，从而导致DNA序列发生变化。“DNA编辑已广泛用于改变基因序列，但在基因被关闭的情况下无济于事。”

失活的Cas9（dCas9）蛋白将附着在DNA上而不切割。实际上，如果没有其他分子附着或吸收它，它通常不会做任何事情。这一研究组之前已经报道了将不同分子结构域连接到dCas9蛋白的多种方法，这些方法将告诉细胞打开基因并重塑染色质结构。

在2016年，Black和Gersbach报道了一种使用基于CRISPR的基因激活来开启基因网络的方法，该基因网络会将成纤维细胞（一种易于接触的组成结缔组织的细胞类型）转化为神经元细胞。这项研究针对的是已知与神经元规格有关的基因网络，但并未产生具有建立有效疾病模型所需的所有特性的细胞。但是，产生这些所需细胞的正确基因网络尚不清楚，并且人类基因组中编码了成千上万种可能性。因此，Black和Gersbach设计了一种策略，可以在一个实验中测试所有网络。

他们从多能干细胞开始，因为这种细胞类型应该能够变成人体内的任何其他细胞。为了利用干细胞制造成熟的神经元，该团队设计了一旦成为神经元的干细胞就会发出红色荧光。荧光越亮，对神经元命运的推动越强。然后，他们建立了一个汇集了数千个导向RNA的文库，这些RNA靶向人类基因组中编码转录因子的所有基因。转录因子是基因网络的主要调节因子，因此要生成所需的神经元，必须将所有正确的转录因子都打开。

他们将CRISPR基因激活剂和导向RNA库引入干细胞，以便每个细胞仅接受单个导向RNA，打开了其特定的相应转录因子基因靶标。然后，他们根据它们变成红色的方式对细胞进行分类，并在最多和最少的红细胞中对RNA进行测序，找到哪些基因打开后会使细胞或多或少地具有神经元的功能。

研究人员分析了由导向RNA改造的干细胞的基因表达，结果表明相应的细胞产生了更特异性和更成熟的神经元类型。他们还发现了同时靶向时共同起作用的基因。此外，实验揭示了拮抗干细胞神经元功能的因素。

但是，这些结果都只是在测量神经元标记。要知道这些工程细胞是否确实能重现更多成熟神经元的功能，就需要测试其传输电信号的能力。

为此，他们求助于Scott Soderling教授，Soderling实验室的研究生Shataakshi Dube使用一种称为膜片钳电生理的技术来测量新形成的神经元内部的电信号。“我对这些干细胞如何变成神经元感到好奇，但也对此表示怀疑，不过，看到这些程序化细胞看起来像正常神经元的程度令人惊讶。”

从干细胞到成熟神经元细胞的过程耗时7天，与其他耗时数周或数月的方法相比，大大缩短了时间。更快的时间表可能会极大地加快神经疾病新疗法的开发和测试。

Gersbach说：“这项工作的关键是开发利用基于CRISPR的DNA靶向能力和可扩展性的方法，将任何功能编程到任何细胞类型中。” “通过利用已经在我们的基因组中编码的基因网络，我们对细胞生物学的控制得到了极大的改善。”

（生物通）

原文标题：

Master Regulators and Cofactors of Human Neuronal Cell Fate Specification Identified by CRISPR Gene Activation Screens