南京医科大学揭示MSC来源的外泌体对骨折愈合的作用

　　

据估计，美国每年大约有1500万新发生的骨折患者，主要是由车祸、运动伤害或工作事故引起。相当一部分的患者（10-15%）会发生延迟愈合或不愈合，这需要延长治疗或重复治疗，对治疗成本和生活质量都有很大影响。骨折的修复是一个复杂的过程，需要利用内源性的细胞再生潜力来恢复原始的骨骼结构。

间充质干细胞（MSC）的移植已经在一些疾病模型中显示出治疗效果，包括在稳定的骨折模型中促进成骨和血管生成。不过，将MSC直接移植到目标组织，仍然存在局限和挑战。比如，在缺血组织中，移植的干细胞存活率极低。此外，其他相关风险也限制了移植MSC在临床上帮助骨折愈合，包括免疫排斥、细胞去分化和肿瘤形成。最近的研究表明，旁分泌机制可能参与了MSC在治疗多种疾病中的作用，而外泌体（exosomes）可能在此过程中发挥重要作用。

研究已经证实，外泌体移植表现出的治疗效果与直接移植的干细胞相似，但不良反应要少得多。之前的一项研究表明，在心肌梗死模型中，MSC来源的外泌体可促进血管生成。此外，MSC的低氧预处理可以明显增加其生物学功能和活性，从而提高MSC在各种疾病模型中的移植效力。不过，目前还不清楚低氧条件下的MSC是否能促进骨折愈合，以及这种增强是否通过外泌体信号传导来介导。

南京医科大学第一附属医院的研究人员在《Acta Biomaterialia》杂志上发表文章，揭示了低氧条件下间充质干细胞来源的外泌体通过转移miR-126而促进骨折愈合。这些结果表明，低氧预处理可作为一种有效的方法，来优化MSC来源的外泌体对骨折愈合的治疗作用。

低氧促进外泌体的释放

研究人员从人类脐带中分离出人脐带间充质干细胞（HucMSC），并分别利用Alizarin Red、Oil Red O和Alcian Blue来鉴定HucMSC的成骨、成脂和软骨分化。在此过程中，他们使用了赛业生物的OriCell™ 成骨、成脂和软骨分化培养基。

接下来，他们确定HucMSC的低氧状况是否会影响它们释放的外泌体。他们在常氧和低氧（1% CO2）下分别接种HucMSC，孵育48小时后从无血清培养基中分离外泌体，并利用电镜、纳米颗粒追踪分析（NTA）和western blot进行分析。与常氧对照相比，低氧条件诱导了外泌体释放的显著增加。后续实验还表明，低氧条件下产生的外泌体更容易被内皮细胞HUVEC吸收。

Hypo-Exo促进血管生成、增殖和迁移

接着，利用小鼠股骨骨折模型，研究人员评估了Hypo-Exo和Exo对骨折愈合的作用。他们利用高分辨率micro-CT扫描后发现，Hypo-Exo的移植可促进骨折愈合。为了进一步确定骨折愈合的原因，他们检测了成骨相关基因（ALP、COLA1和OCN）和血管生成相关基因（VEGF）。结果表明，Hypo-Exo主要通过血管生成而促进骨折愈合。

为了确定Hypo-Exo在体外是否发挥相似的治疗作用，研究人员利用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）开展体外实验。细胞增殖分析表明，与Hypo-Exo共同孵育导致HUVEC的增殖显著增加。同时，细胞迁移分析也表明Hypo-Exo增强了血管形成能力。这些结果表明，与体外的PBS和Exo处理相比，Hypo-Exo可大大促进增殖、迁移和血管形成（图1）。

图1. Hypo-Exo在体外促进了HUVEC的细胞增殖、迁移和血管形成

Hypo-Exo中的miR-126上调

之后，研究人员通过实验证实，来自Hypo-Exo中的miRNA可能发挥生物学作用，并最终促进骨折愈合。具体是哪个或哪些miRNA？他们开展了miRNA芯片分析，发现Hypo-Exo组中有94个miRNA上调，39个下调。其中，miR-126的表达明显上调，且已知其对血管生成具有积极作用。于是，他们后续的研究重点放在miR-126上。

研究人员想了解miR-126是否充当了低氧MSC与HUVEC之间的生物学信使，并可以调节血管生成。通过一系列体外和体内的功能获得和功能丧失分析，他们发现外泌体miR-126的knockdown能够在体外和体内抑制内皮细胞的增殖，表明miR-126在Hypo-Exo介导的血管生成中发挥重要功能。通过进一步的分析，他们确认SPRED1是miR-126的目标基因（图2）。

图2. miR-126的knockdown在体外和体内抑制了Hypo-Exo介导的细胞增殖、迁移和血管生成

之前的研究表明，低氧诱导因子-1（HIF-1α）对于低氧期间miRNA的表达至关重要。因此，研究人员想了解HIF-1α是否调节外泌体中的miR-126。通过转染siRNA，他们发现HIF-1α的下调显著降低了低氧诱导的miR-126表达。后续的分析表明，HIF-1α诱导了miR-126的表达及其在外泌体中的负荷。

结论

通过一系列的体内体外实验，这项研究证实了Hypo-Exo通过外泌体miR-126促进骨折愈合的机制。研究人员认为，低氧可能通过HIF-1α的作用来介导miR-126的产生。因此，低氧预处理是一种有效的方法，有望优化MSC来源的外泌体在骨折愈合中的治疗作用。
 
原文检索
Wei Liu , Linwei Li , Yuluo Rong , Dingfei Qian , Jian Chen , Zheng Zhou , Yongjun Luo , Dongdong Jiang , Lin Cheng , Shujie Zhao , Fanqi Kong , Jiaxing Wang , Zhimin Zhou , Tao Xu , Fangyi Gong , Yifan Huang , Changjiang Gu , Xuan Zhao , Jianling Bai , Feng Wang , Wene Zhao , Le Zhang , Xiaoyan Li , Guoyong Yin , Jin Fan , Weihua Cai , Hypoxic mesenchymal stem cell-derived exosomes promote bone fracture healing by the transfer of miR-126, Acta Biomaterialia (2019),
doi: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.12.020

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