DNA+RNA全视角解读水稻根际微生物组

　　

近期，派森诺生物与中国科学院合作，在《Science of the Total Environment》（最新影响因子5.589）发表论文。本研究基于DNA层面的16S rRNA基因和RNA层面的16S rRNA的高通量测序，分别探究了水稻根际土总微生物组和活性微生物组的群落特征，以全面展现根际效应对根际土壤微生物组的重要影响。
 
研究背景

根际微生物组对植物的生长和健康有着至关重要的作用，被认为是植物第二基因组的一部分。根际微生物通过影响反硝化、硝化和呼吸等根际生物进程来调节生物地球化学循环。以水稻土为例，潜在的铁还原剂（如Geobacter 和Anaeromyxobacter）在根际显著富集，表明根际微生物对土壤铁循环有着重要影响。根际有益微生物通过加强植物对水分和营养的摄取、减少过多重金属摄入、诱导植物对病原菌产生抗性等促进植物健康生长。

根际微生物在土壤中有四个生理阶段：活跃期、潜在活跃期、休眠期和死亡期。活性微生物只占所有微生物的一小部分，它们直接参与生物地球化学循环，因此活性微生物的研究将为土壤功能微生物研究提供更为准确的信息。通过比较活性菌和总微生物群落结构的差异能够更好地理解微生物对环境变化的响应。

根际微生物群落结构在不同植物基因型、植物种类、土壤类型和植物的生长阶段有着显著的差异。水稻淹水后的土壤含氧量有限，但由于水稻根系释放氧气，使其根际相对于非根际土壤是一个含氧区，这就造成了从根表面到非根际土壤持续的氧化还原和养分梯度。根系分泌物的丰度和多样性取决于植物的生长发育阶段，因为它能够影响土壤的氧化还原和养分梯度，进而影响土壤微生物群落。

得益于下一代高通量测序，很多研究报道了根际土壤微生物的群落组成和结构，但土壤活性微生物组和总微生物组相结合的研究较少，因此本研究结合DNA层面的16S rRNA基因和RNA层面的16S rRNA高通量测序，以比较水稻土活性细菌和总细菌群落结构的差异。
 
研究目的

➤ 探究水稻不同的生长阶段和土壤区域对土壤细菌群落的影响；

➤ 比较水稻土活性细菌和总细菌群落结构的差异。
 
研究方法

测序技术：Illumina MiSeq高通量测序平台           
测序模式：细菌16S rRNA 基因V4V5区+16S rRNA V4V5区
实验对象：水稻不同生长时期的根际土和非根际土

实验设计

研究结果

土壤和孔隙水化学性质

铵离子（NH4+soil）浓度和pH水平在根际土中显著低于非根际土，而亚硝酸盐和硝酸盐（NOx-soil）浓度在根际土中显著高于非根际土。低分子量有机酸（LMWOAs）和总有机碳（TOCsoil）在水稻的不同生长阶段有着不一样的含量，并且在根际土中高于非根际土。孔隙水（pw）中的NH4+pw、NOx-pw、TOCpw和TNpw（总氮）浓度随着水稻的生长发育而减少，并且NH4+pw在根际土的下降速度比非根际土的下降速度更快，而TOCpw和NOx-pw含量在根际土中高于非根际土。与总细菌群落相比，活性菌群落有着更为明显的多样性变化。

基于DNA和RNA水平测定的根际土细菌群落结构

实验一共包含29098个OTUs，共29,906,509条序列，其中包括293个古菌OTUs共151,884条序列。在根际土中，基于RNA水平的群落Chao1指数范围为成熟期的4628到幼苗期的5653，基于DNA水平的群落Chao1指数范围为幼苗期的4663到成熟期的6739（表1）。表1显示测序的覆盖率为95.6%-97.9%，表明土壤中的大部分细菌类群已被覆盖。基于16S rRNA基因的细菌多样性在不同生长阶段和土壤间的变化不明显，而基于16S rRNA的细菌多样性在不同土壤间变化显著。

表1：基于16S rRNA和16S rRNA基因测序的细菌群落结构参数

基于16S rRNA测序的细菌群落共有65个优势OTUs以及3752-5698个稀有OTU，基于16S rRNA基因测序的细菌群落共有57个优势OTUs以及3005-4856个稀有OTU，两者共同拥有38个优势OTUs。基于总OTUs（图1a）、优势OTUs（图1b）和稀有OTUs（图1c）的总细菌群落结构和活性细菌群落结构有着显著差异。基于DNA水平和RNA水平检测到的细菌群落在门水平（图2a）和目水平（图2b）相互分离。一共有98个细菌类群的相对丰度在RNA和DNA检测水平之间有着显著差异。Euryarchaeota、Saprospirae、Bacilli、Plancyomycetes、OD1 group、β-Proteobacteria 和Mollicutes在DNA检测水平的相对丰度更高，而Acidobacteria、Cyanobacteria、Elusimicrobia、Fibrobacteres、Clostridia、α-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Rhodocydales 和Verrucomicrobia在RNA检测水平的相对丰度更高（图3）。一些目水平微生物，在活性细菌群落中占有很大的比例，但在总细菌群落中丰度却很低。例如，Rhodospirillales、Methylococcales、Spirochaetales 和Myxococcales 在活性细菌群落中的相对丰度大于2%，但它们在总细菌群落中的平均相对丰度不到0.8%（图2b）。

图1：基于Bray-Curtis距离的微生物群落结构PCoA分析

图2：基于门水平（a）和目水平（b）的细菌组成聚类分析

图3 样本间细菌类群相对丰度热图

活性细菌群落组成在水稻不同生长时期都比较稳定，但在根际和非根际土之间有着显著差异（图1a，b，c）。在总细菌群落中，只有属于Bacilli的7个类群在根际土和非根际土之间有显著差异。而在活性细菌群落中，有34个类群在根际土和非根际土之间有显著差异，其中Oxobacter、Lachnospiraceae、Coprococcus、α-Proteobacteria、Rhodospirillales、Rhodospirillaceae 和Magnetospirillum 的相对丰度在根际土中远远高于非根际土（图3）。

环境因素和根系分泌物对细菌群落的影响

本研究通过CAP分析反映土壤和孔隙水化学性质以及根系分泌物对细菌群落结构的影响（表2）。结果显示扩增的方式（以DNA或cDNA为模板）分别能解释基于总OTUs、优势OTUs和稀有OTUs 43.6%-57.2%、47.7%-61.7%和12.0%-17.4%的结构变化。土壤区域分别能解释基于总OTUs、优势OTUs和稀有OTUs 5.1%-5.4%、5.0%-5.9% 和4.4%-4.8%的结构变化。此外土壤区域能够解释11.5%-20.8%活性菌在根际土和非根际土中的变化（基于总OTUs：13.8%-18.0%；基于优势OTUs：14.6%-20.8%；基于稀有OTUs：1.4%-12.4%），TOCpw解释比例次之（分别解释9.5%-9.7%、4.3%-10.3%和9.4%-10.4%）。CAP结果表明水稻的生长发育阶段（11.5%-11.8%）和草酸含量（10.8%-11.1%）显著影响活性细菌中稀有OTUs的模式。土壤性质（如NH4+soil、TNsoil和C/Nsoil）、pH和琥珀酸盐是影响总细菌群落结构重要因素，而水分和NH4+pw分别解释了总细菌群落10.2%-10.9%和10.4%-10.8%的变化。

表2：不同因素对细菌群落变化影响的CAP分析

总结

本研究通过水稻不同生长发育阶段根际土和非根际土DNA层面的16S rRNA基因和RNA层面的16S rRNA的高通量测序，发现总细菌群落的多样性高于活性细菌群落的多样性，而活性细菌对根系变化更为敏感。土壤区域对细菌群落的影响远大于水稻不同生长时期带来的影响，尤其在rRNA水平。以上结果表明根际对根际细菌群落结构有重要影响，并且对活性菌和总细菌群落有着不同的影响。
 
本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
 
文章索引

Hu Li et al. Distinct rhizosphere effect on active and total bacterial communities in paddy soils. Science of the Total Environment 649(2019):422-430.