一种新型单细胞小RNA测序方法问世，Nature子刊发现人卵细胞中新的小RNA家族

　　

非编码小RNA是基因表达调控网络的重要组成部分，参与调控细胞内三分之一以上的基因表达，功能涉及生命活动的几乎所有方面，因此，在单细胞水平解析和研究小RNA的表达和调控网络意义重大。纵观单细胞二代测序技术，单细胞转录组和基因组测序早在十年前就已成为现实并得到了广泛应用，但小RNA由于其长度短和特殊的生化性质，一直是单细胞测序技术领域的难点，直到最近才有突破，但大量的接头自连副产物造成测序产出率不到20%，也无法精确检测到低丰度的小RNA。

来自中科院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）吴立刚和李逸平实验室的研究成果：“Single-cell CAS-seq reveals a class of short PIWI-interacting RNAs in human oocytes"。该研究发明了单细胞小RNA深度测序技术CAS-seq，并运用该技术绘制了首个人和猴卵细胞的小RNA表达谱，鉴定发现了一类新的小RNA家族。

这一研究发现公布在刊7月29日的Nature Communication杂志上，文章通讯作者为吴立刚研究员、李逸平研究员，第一作者为杨其元、李荣红、侯丽、上海交通大学附属第九人民医院吕祁峰医生。

这一研究创新性地运用Cas9-sgRNA复合物对非经典的RNA/DNA杂合链进行切割，从而高效、特异地清除接头自连副产物，同时，研究人员引入了IVT线性扩增技术，将小RNA序列信号线性扩增近一千倍，极大地提高了小RNA测序的灵敏度和准确性，建成高精度的单细胞小RNA深度测序技术CAS-seq。

受精卵是个体生命的起点。对小鼠和斑马鱼的研究表明小RNA在卵细胞和胚胎发育过程中起着不可或缺的调控功能。而受精卵中绝大部分的小RNA都由卵细胞所贡献。因此了解卵细胞中小RNA种类、丰度及在受精卵后发育过程中的动态变化尤为重要。由于缺乏有效的单细胞小RNA测序技术，目前已报道的哺乳动物卵细胞小RNA表达谱仅限于小鼠和牛，对于人和其它灵长类动物卵细胞中的小RNA谱系还是完全未知。

研究人员运用CAS-seq技术对人和食蟹猴的单个卵细胞进行了小RNA测序，发现了一类长度约为20nt（碱基）的新小RNA家族，表达量占卵细胞中小RNA总量的60%。该家族的小RNA由几十万种不同序列的小RNA组成，第一位的碱基有极强的U偏好性（>98%），在基因组上集聚分布，形成几百个簇。RIP-seq实验证实这种小RNA与PIWI家族的PIWIL3蛋白特异性结合，因此属于piRNA大家族。

这种新类型的小RNA大量存在于人卵细胞中，在桑椹胚时期几乎完全消失，在其它组织中不表达，长度明显短于已知的piRNA，因此研究人员将其命名为oocyte specific short piRNA (os-piRNA)。末端氧化/测序实验发现os-piRNA 的3’末端没有甲基化修饰，与已知的piRNA都不相同。结合人卵细胞录组测序数据综合分析发现os-piRNA倾向于靶向灵长类特有的转座子元件，切割产生具有1U和10A序列特征的正义链os-piRNA。

有趣的是，灵长类卵细胞中没有endosiRNA的表达，推测os-piRNA可能替代了小鼠卵细胞中endo-siRNA沉默转座子的功能。该研究首次绘制了人类卵细胞与早期胚胎完整的小RNA谱系，发现了新的os-piRNA，为研究灵长类动物卵细胞和早期胚胎发育中小RNA的功能和机制打开了一扇新的大门。
 
原文标题：

Single-cell CAS-seq reveals a class of short PIWI-interacting RNAs in human oocytes