定量western blot：为什么需要验证抗体[心得点评]

验证抗体对于结果的一致性和重复性是至关重要的，即确认抗体能特异性识别感兴趣的蛋白，抗体与其他蛋白的交叉反应性情况。在您的论文提交给期刊发表之前，经常需要验证抗体的特异性，但并非所有人都花时间进行验证。或者很多人都认为他们使用抗体进行了免疫共沉淀验证，因而不需要再通过蛋白质印迹进行验证。然而，抗体与抗原的亲和性高度依赖于实验条件，因此，验证您的试验方法中的条件适用于抗体与抗原的结合是十分重要的。

定量western blot尤其适用于确认获得的信号仅来自感兴趣的蛋白。如果没有进行抗体验证（并且验证荧光信号与蛋白质的量呈线性关系），将无法获得下游定量分析所需的准确度和精确度。

为确保实验质量，国际抗体验证工作组提供了五种不同的抗体验证方法，其中四种方法适用于western blot，他们建议至少使用其中两种方法进行抗体验证。

遗传策略

尽管这些方法已经被更新了，但在科研领域中的生物化学家对他们应该都很熟悉。即用CRISPR-Cas9或RNA干扰（RNAi）在实验组和对照组中进行敲除或敲低实验，然后使用特异性抗体测定目标蛋白的荧光信号。处理后的目标蛋白质的表达很少甚至没有，所以观察到的任何信号都表明抗体存在交叉反应性。

如下图所示，将具有特定蛋白质的细胞裂解物进行western blot，分别使用两种不同siRNA分子敲低目的蛋白的表达，如泳道1和泳道2，与泳道C的对照组相比，我们可以看出siRNA脱靶带来的影响。

正交策略

这种方法的技术含量较低，它使用不依赖于抗体的方法（质谱法）来量化几个蛋白样品的靶信号，然后使用基于抗体的方法（western blot）同样量化相同蛋白样品的靶信号，最后将他们的信号值进行比较。例如，有几种靶向蛋白质组学方法可以量化不同样品中的蛋白质表达。当对抗体进行标记时应参考这些相关的定量数据。

下图比较了蛋白质印迹和质谱法测定蛋白表达量的相关性。通过对八种细胞系中蛋白表达量的测定，我们可以看到他们的相关性高达0.97，表明该抗体对于蛋白质印迹分析是有效的。

独立抗体策略

使用针对相同靶标的两种或更多种不同抗体是测量抗体特异性的直观且有效的方法。在相同的实验条件中测定抗体相关性十分重要。如果抗体具有不同的抗体表位（即抗体结合抗原的不同区域）则表明该抗体是独立的。这样，它们不可能表现出脱靶效应并结合与该研究无关的同一蛋白质，这种方法可结合敲除或敲低的方法一起使用。

如下图，对目的蛋白使用了两种独立的抗体，并且我们可以确定来自八种细胞系中的每一种信号的相关性。注意要检查整块凝胶，因为脱靶效应带来的结果是非特异条带可能在整块胶的任意位置。

表达带有标签的蛋白

还可以通过表达具有亲和标签（例如FLAG或v5）或荧光蛋白（例如GFP或YFP）的蛋白质来验证抗体。然后可以使抗体表达与另一种方法的表达相匹配，但是这种方法局限性在于最好标记内源基因。值得注意的是过表达目标蛋白可能会人为地淹没脱靶结合，然后无法验证抗体。

验证抗体对于western blot实验十分重要，并且western反过来可以用来验证ELISA或者IHC。

Azure有两种产品可帮助确认您的抗体是否具有特异性和选择性结合：

（1）HRP偶联的二抗：可用来检测化学发光WB中的低丰度蛋白质；
（2）荧光二抗：在荧光Western blot中发射可见光和近红外波长的光。

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