数字PCR引物探针设计——Gene-π课堂之二

上一讲我们给大家介绍了数字PCR的原理及应用，今天给大家讲一讲引物探针的设计。好的引物探针是实验成功的关键。详细信息可登陆网站或扫描二维码查看。

   

数字PCR引物与普通PCR引物设计要求不同：普通PCR的目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格；而数字PCR引物跟real-time PCR引物一样对非特异性反应和引物二聚体要求严格。

引物及探针设计的总体原则

▪ 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
▪ 所选列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段。
▪ 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在50-150bp内。
▪ 保持GC含量在30%~80%之间。
▪ 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）。
▪ 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发夹结构的形成。
▪ 一些需额外考虑的因素：
  ◦ 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 。
  ◦ 如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
  ◦ 尽量避免Dimer（二聚体）配对区域在3’末端。
  ◦ 尽量避免3’末端连续几个碱基错配形成False priming（错配）
  ◦ 衡量二级结构的稳定性
  如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应；尽量保证自由能的绝对值<10（可选）
  ◦ 为了避免基因表达过程中检测到DNA，设计应尽量跨内含子区，这可确保扩增的产品只能使用mRNA作为模板。

引物设计基本原则：

▪ 扩增片段长度：50-150个碱基
▪ 引物长度：18-24个碱基（20个碱基最优）
▪ Tm值：58℃到 60℃，引物之间的Tm相差避免超过2℃
▪ GC含量：30%到80%
▪ 3’端的最后5个碱基内不应有超过2个G+C
▪ 尽量避免重复的核苷酸序列，尤其是不能有4个连续的G
▪ 探针位置尽可能地靠近上游引物，但不能重叠

探针设计基本原则：

▪ 探针长度：13-25个碱基（MGB探针）
 13-30个碱基（普通Taqman探针）
▪ Tm值：68 °C 到 70 °C（PrimerExpress 计算结果）
 通常比引物Tm值高5-10℃（至少要5℃）
▪ GC含量：30%到80%
▪ 5’端第一个碱基不能为G
▪ 尽量避免重复的核苷酸序列，尤其是不能有4个连续的G；避免6个连续的A出现
▪ 对于MGB探针，尽量避免在探针的中部出现2个或2个以上连续的C，3’端的碱基应避免为“GGG”或“GGAG”
▪ 对于FAM 标记的探针，5’端的第二个碱基不能为G
▪ 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量

探针荧光标记物选择：

多重探针设计原则：

▪ 所有靶基因的引物或探针的Tm 值要相接近，引物的Tm 值建议在55-60℃，探针的Tm 值高于引物Tm 值5-10℃。
▪ 不同靶基因的探针标记不同的荧光基团，比如FAM、HEX或CY5，并且要选择发射波长之间渗透最小的荧光报告基团，
▪ 同时要与数字PCR 系统的荧光检测通道参数兼容。

推荐引物探针设计软件：Beacon designer、Primer 3、Primer express等

加入GENE-π数字PCR技术学堂，畅游在数字PCR技术的海洋

联系我们：
北京深蓝云生物科技有限公司
地址：北京市北京经济技术开发区经海四路25号院2号楼2单元2层201室
电话：[phone]
邮箱：[e-mail]
官网：www.cycloudbio.com