中国学者Nature Biotechnology首次使用RNA模板实现同源重组修复

　　

自2012年CRISPR/Cas基因组编辑技术被发明以来，已被广泛应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组编辑。基因组编辑首先在基因组靶向位置产生DNA双链断裂（DSB），这些产生的DSB可通过非同源末端连接（NHEJ）或者HDR途径进行修复。

NHEJ最常用于移码突变破坏基因功能，而HDR主要被用于对靶标序列的精准替换或定点插入。在多数物种中，NHEJ是DSB最主要的修复途径，而通过HDR途径进行精准修复的概率特别低。HDR修复途径需要额外提供同源重组的供体作为修复的模板，在动物中可以较容易地将CRISPR/Cas系统及同源重组供体递送入细胞中，而在植物中，主要通过农杆菌侵染或基因枪轰击愈伤的方式来进行CRISPR/Cas系统以及DNA供体的递送。

虽然利用基因枪转化或者双生病毒系统可以提高DNA模板数量进而提高HDR的发生概率，但是实现高效率的植物同源重组依然是一个巨大的挑战，因此限制了基因组编辑的拓展应用。

来自中国农业科学院作物科学研究所，美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员合作，发表了题为“Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination”的文章，使用RNA作为同源重组修复（HDR）的模板，并分别利用核酶自切割和具有RNA/DNA双重切割能力的CRISPR/Cpf1基因编辑系统，成功获得后代无转基因成分的抗ALS抑制剂类除草剂水稻植株。

这项研究公布在3月19日的Nature Biotechnology杂志上，是在植物中首次成功利用RNA作为同源重组修复模板，开辟了利用植物RNA作为同源供体模板进行同源修复的新思路，是植物基因组编辑领域的重大进展。

研究人员首先利用分子生物学手段并对重组事件进行评估，证实了将RNA作为同源重组修复模板，参与CRISPR/Cpf1介导的DNA同源重组修复的可行性。与通常使用的DNA模板不同，RNA模板可以在体内通过植物自身的转录系统持续产生，为同源重组修复提供更多的模板。

同时，选择具有RNA/DNA双重切割能力的CRISPR/Cpf1基因编辑系统，在细胞核内同时加工产生用于靶向目标序列的crRNA及一起转录的模板RNA，既产生了DSB又提供了同源重组修复的RNA模板，成功获得OsALS两个氨基酸定点替换成功的抗嘧啶羧酸类除草剂水稻植株，且在子代分离得到了定点替换成功且无外源转基因成分的植株。该项成果首次证明，除了通常使用的DNA模板，RNA同样可作为植物同源重组修复的模板。

在此研究基础上，进一步优化该策略的效率，有望解决目前植物同源重组频率低下的难题，加速通过基因编辑技术，精准改良农作物重要农艺性状，进而定向创制农作物新种质的育种进程。

原文标题：

Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination