国内首篇！安诺 Sequel II测序成果在线发表于Cell Research

2019年10月7日，来自同济大学生命科学与技术学院的杨鹏、高绍荣和王译萱研究团队于Cell Research（IF=17.848）上在线发表文章，揭示了Dux的精准调控是早期胚胎发育的关键但非必要条件，并利用三代Sequel II测序证实了Dux-KO小鼠中的大片段缺失。这也是国内首篇使用Sequel II测序数据发表的文章，安诺基因在本次研究中承担了三代重测序的工作。

　　

2019年10月7日，来自同济大学生命科学与技术学院的杨鹏、高绍荣和王译萱研究团队于Cell Research（IF=17.848）上在线发表题为Precise temporal regulation of Dux is important for embryo development的文章，揭示了Dux的精准调控是早期胚胎发育的关键但非必要条件，并利用三代Sequel II测序证实了Dux-KO小鼠中的大片段缺失。这也是国内首篇使用Sequel II测序数据发表的文章，安诺基因在本次研究中承担了三代重测序的工作。

样本选择

Dux-KO小鼠的肝脏和肌肉组织

测序策略

PacBio Sequel II测序，构建30 kb CLR文库

实验设计

主要结果

1. 合子基因激活（ZGA）是通过母本向合子转换这一过程实现的，该过程中母本的RNA和蛋白质发生降解，合子基因被转录激活。近期有研究发现Dux是调控ZGA过程的主要诱导因子，它与ZGA转录本结合并快速将其激活，触发胚胎细胞的发育进程。为验证Dux在ZGA及胚胎发育中的重要作用，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了Dux-KO小鼠模型。将Cas9核酸酶mRNA和两个针对Dux的sgRNA注入受精卵并转移到假孕受体中，之后获得基因经过编辑的F0代。令F0与具有相同遗传背景的野生型（WT）进行回交，获得F1后再次与WT回交，从而获得具有相同突变的杂合Dux+/-（Dux-Het）小鼠，纯合Dux-KO小鼠通过杂合小鼠间的自交产生。

2.

Dux-KO和WT小鼠的Dux基因簇分布

利用三代重测序技术对Dux-KO小鼠的基因型进行进一步确认，发现了LOC100504180（Duxf1）、Dux（Duxf3）和Gm4981（Duxf4）的大片段缺失，以及Gm10807（Duxf2）、Gm9919（Duxf5）的短片段缺失，体现了PacBio长读长测序在检测大片段结构变异方面的优势。

Dux-KO小鼠可以存活到成年，但其频率与孟德尔分布略有偏离（下图左)。Dux-KO小鼠交配所产生的后代相比WT或Dux-Het的后代更少。因此，Dux缺失虽然不致死，但会导致产仔数量的显著减少，表明Dux是早期胚胎发育的关键但非必要因素。

Dux缺失导致产仔数量的显著减少

3. 为进一步验证Dux缺失在胚胎中的影响，研究人员采集了Dux-KO和WT个体在多个时期的胚胎，包含受精卵和早中晚期的2C（二细胞）胚胎，进行单细胞转录组（Smart-seq2）分析。Dux仅在早期2C阶段短暂表达，通过对比Dux-KO和WT胚胎在2C阶段各个时期ZGA相关基因的表达，发现在Dux缺失的条件下ZGA过程仍然可以被激活，但发生的时机被推迟（下图d-e）。

WT与Dux-KO胚胎在2C阶段基因表达情况比较

MERVL通常在受精卵阶段就能被检测到，早于Dux的表达，它可以与一些2C基因生成嵌合转录本，促进附近的2C基因表达。在Dux-KO胚胎中发现MERVL在2C阶段的中晚期显著上调（上图f），这与ZGA关联基因的激活显著相关，表明Dux是通过增强而不是直接激活来调控ZGA转录本的表达。

4.  在胚胎的2C晚期阶段通常已经检测不到Dux的表达，研究人员为深入探究Dux在早期胚胎发育中的功能，将Dux-EGFP（Dux-OE组）与对照组EGFP的mRNA注射到2C期胚胎的卵裂球中，利用免疫染色法观察胚胎的发育进程。对照组的表达一直持续到囊胚阶段，而Dux-EGFP的表达在8 h后剧烈减弱，且胚胎发育停止在4C阶段。这些结果表明Dux在胚胎中的延长表达会导致早期胚胎的发育受阻。

Dux在胚胎中的延长表达导致早期胚胎的发育受阻

5. 无论内源还是外源的Dux表达均在胚胎中仅持续了数个小时，尤其当Dux mRNA被注射到受精卵中后，Dux-EGFP在3-5h内剧烈降解，且对胚胎发育未产生影响（下图a-c）。这也进一步表明了Dux的降解对胚胎发育的重要影响。蛋白酶抑制剂MG132的使用大大延迟了受精卵中Dux-EGFP信号的衰减，使得发育受阻（下图d）。此外，Dux-EGFP在NIH3T3细胞系中的过表达也揭示了Dux不仅与ZGA相关蛋白相互作用，也和泛素途径相关蛋白发生相互作用（下图e）。

外源Dux-EGFP在受精卵中剧烈降解

综上，本项研究表明了Dux通过增强而不是直接激活ZGA来调控早期胚胎的发育过程。尽管Dux敲除小鼠可以存活至成年，但Dux的缺失会推迟ZGA过程并降低胚胎发育的潜能。此外，Dux在2C阶段早期短暂表达后，会在DNA水平被沉默并在RNA与蛋白水平被降解，长期激活会严重损害早期胚胎的发育。

PacBio长读长测序在检测结构变异（SV）方面具有无可比拟的优势，弥补了此前基于二代测序只能集中于分析SNP、InDel等小片段变异的不足，能够更精准地识别大于50 bp的染色体插入、缺失、倒位、易位等，即使是重复区域也能轻松跨越，从而简化分析，使检测分析更准确高效。

自2017年推出三代测序服务以来，安诺优达先后引进了10台PacBio Sequel和4台Sequel II测序仪，产品服务类型涵盖三代基因组组装、人重测序、动植物重测序、全长转录组测序等，累计完成三代项目超800+。2019年7月，安诺优达测序实验室又荣获PacBio官方认证测序服务商证书。安诺优达将秉承客户至上的服务理念为合作伙伴提供更快速、更优质的三代测序服务。

参考文献

Guo Mingyue., Zhang Yanping., Zhou Jianfeng., Bi Yan., Xu Junqin., Xu Ce., Kou Xiaochen., Zhao Yanhong., Li Yanhe., Tu Zhifen., Liu Kuisheng., Lin Jiaming., Yang Peng., Gao Shaorong., Wang Yixuan., (2019). Precise temporal regulation of Dux is important for embryo development[J], Cell Res., undefined, undefined.