基因编辑动物的子代是否健康？

基因编辑无角公牛繁育子代分析为基因编辑动物监管和育种带来希望

研究报告提供了对经过T均ALENs基因编辑获得PC POLLED无角等位基因纯合子公牛RCI002的子代的详细分析，6个子代均获得无角性状遗传，全部健康，没有脱靶。但发现公牛RCI002其中一个等位基因上额外插入的载体序列也被遗传给4个子代。分析结果为基因编辑技术进入动物育种领域带来希望，也提示基因编辑的载体选择重要性。

　　

安格斯牛（Angus）天生就没有角，占地小且不会对彼此或农场工人造成伤害；而荷斯坦牛（Holsteins）和泽西牛（Jerseys）这样有角的牛则需要在牛犊时去除它们的角。由Alison Van Eenennaam领导的加利福尼亚大学戴维斯分校的研究人员一直在探索使用基因组编辑工具将无角基因引入荷斯坦牛，这样可以免去角处理。Eenennaam和她的同事们现在在《Nature Biotechnology》上发表一篇报告，一头荷斯坦/泽西杂交牛（原本有角）经过基因组编辑获得无角显性纯合基因的公牛（RCI002，2016年）在与有角的赫里福德牛（Hereford）杂交产生了六头杂合的小牛，所有小牛都继承了无角基因且健康的，但有四头小牛获得的等位基因上带有载体质粒序列插入。这表明基因组编辑动物可以将已编辑的特征传递给子代。研究人员对小牛进行了测序，发现没有其他意外基因组变化的证据。这些牛将被视为转基因动物而进行焚化销毁，但范·埃纳纳姆（Van Eenennaam）希望，她的研究结果将使美国食品药品监督管理局（FDA）放宽对这类种内DNA编辑的动物的限制。她说：“在我们的生产系统中改善物种遗传可能确实对诸如抗病性之类将非常有益，并且符合许多可持续性目标。”

在现代养牛产业中，由于无角牛不会伤害其他同类、只需要较小的饲喂空间、处理和运输的危险较小、攻击行为也较少，常规做法会对有角牛实施去角术，即在小牛的牛角细胞生长并附着到头骨之前将其破坏，这是一个不愉快的过程，在重视动物福利的美国，许多团体一直都在争取替代性的人道解决方案。一种做法是筛选繁殖没有角的牛，这种动物的表型被称为“无角”。

先前其他人已经报道了通过细胞质注射（CPI）引导RNA（gRNA）和Cas9到单细胞期受精卵进行基因组编辑（CRISPR/Cas9），获得基因敲除牲畜。经基因组编辑的绵羊与其亲本进行比较；经基因组编辑的山羊与其子代进行比较，两项研究得出的结论是，基因编辑动物和未编辑同类的de novo突变率相当。第三项研究对两头基因组编辑小牛上进行无偏向性全基因组测序，这两头小牛使用同源性定向修复（HDR）供体质粒的CPI和TALENs靶向敲除早期胚胎中的β-乳球蛋白基因，结果没有发现小牛出现任何TALEN介导的脱靶突变或供体质粒整合事件。

2016年，Carlson等人报道了通过使用转录激活因子样效应子核酸酶（TALENs）对来自明尼苏达大学（University of Minnesota）杂交育种牛供体细胞进行基因组编辑并经过生殖克隆，将PC（Celtic POLLED）无角等位基因转入两头雄性奶牛中。这两头转基因公牛RCI001和RCI002经过全基因组测序（WGS）没有发现任何脱靶变异，两头公牛成熟后都没有形成角。这些经过基因组编辑的无角公牛被转移到加州大学戴维斯分校。

基因编辑技术可能需要引入多种动物中以防止遗传瓶颈。而根据风险与证据建立全球一致且适当的监管框架，对于允许研究的开展和促进有用的应用开发至关重要。如要将基因组编辑工具无缝地整合到牲畜遗传改良程序中，则需要对这些基因编辑动物进行深入的表征化工作。为了提供数据以指导未来的监管框架并惠及牲畜基因组编辑的未来应用，研究人员建立了一个繁殖实验，以研究无角基因组编辑是否忠实地传递给子代，以及这些子代中是否存在独特的表型或基因型变化。

实验选择了一头经过基因组编辑获得无角性状的公牛RCI002，这头公牛来自明尼苏达大学的奶牛杂交计划，已知是62.5％的荷斯坦，25％的Montbelliarde和12.5％的泽西牛杂交有角品种。采集其冷冻保存精液，通过人工受精给十只赫里福德（Hereford）角牛，结果获得六头小牛，一胎为雌性，五胎为雄性。这一妊娠率为60％，与类似的发情同步+人工授精方案中报道的妊娠率相当。同步对照包括纯种有角的赫里福德小牛（两雌一雄），赫里福德与荷斯坦(HO1)(与基因组编辑公牛同种）杂交小牛（一雌两雄）。

评估小牛健康
小牛出生时没有发生任何意外事件，只有一只荷斯坦(HO1）×赫里福德对照犊牛是臀位，出生时需要进行兽医干预。在大约一个星期的龄期对所有小牛进行了全面的兽医体检，包括触诊是否有角芽。基因组编辑公牛的子代小牛没有角芽，但对照小牛有角芽。所有常规的物理参数均在正常范围内，并且基因组编辑公牛子代与对照组子代小牛具有可比性。所有公牛犊都有两个下降的睾丸，但在基因组编辑无角公牛的一个子代（RC.calf6）有一个下降睾丸和一个隐睾睾丸。全血细胞计数和血液化学分析结果在所有犊牛组中均相当。

使用Illumina HiSeq4000对所有动物以约20倍的覆盖率进行全基因组测序。生物信息学分析显示，基因编辑无角公牛（RCI002）携带一个天然存在的PC Celtic POLLED无角等位基因，而另一个PC Celtic等位基因上包含了额外插入的同源定向的修复供体质粒。基因编辑公牛的这一对等位基因在子代中分离，任一等位基因的遗传都产生了无角的小牛。没有观察到其他意外的基因组改变。

角表型的评估
由基因组编辑的无角公牛所生的小牛没有发育成角。但是，公牛犊确实出现了杂乱无章的角质生长，大小不一并在与角相同的区域发育，但没有牢固地附着在头骨上，这是公牛无角基因杂合的常见现象，因此这一结果未超出正常参数范围。小母牛没有出现角质生长。 未被焚毁的剩下一只雌性小牛已经23个月大，还没有发育成角。

插入稳定性评估
使用序列诱饵方法来研究PC POLLED等位基因的212碱基对重复是否插入了基因组中除预期位置以外的任何位置。结果表明PC POLLED等位基因没有插入到基因组中预期位置以外的任何位置。

评估质粒序列的存在
短读基因组序列与供体质粒pCR 2.1（Life Technologies）的比对显示，除了预期的PC POLLED等位基因外，整个3.9kb pCR 2.1质粒序列和一个额外的PC HDR模板插入了基因编辑公牛（RCI002）的一个等位基因。这个插入稳定地传播给六个子代中的四个（RC.calf1、4、5、6）。进一步的基于PCR的分析和Sanger测序证实在这5只动物中（4小1大）存在该质粒插入片段。长读纳米孔WGS产生了约430万个读取，包含约3,700万个核苷酸，从而实现了RCI002基因组的13.7倍覆盖率。

在大约8和12月龄时，还进行了其他兽医物理检查，以评估相同的指标。所有小牛均健康，所有参数均在正常范围内。此外，按照基因组学学会制定的标准，经过基因组编辑的后代和对照后代组的公牛犊在15个月大时进行了繁殖健全性检查。来自基因组编辑后代组的四头小公牛通过鉴定为令人满意的潜在育种牛，另一头小公牛（RC.calf6）由于隐睾而不能令人满意。所有对照公牛都是令人满意的潜在育种牛。在研究期间，任何组的小牛都没有任何重大的健康事件。这项研究完成后，对公牛RCI002及其五个雄性后代实施了安乐死并焚化，因为它们的有目的性基因组编辑属于未经批准的动物药，因此不能投放市场进入食品供应。

这是首次报道的由基因组编辑的公牛繁育的后代。这些数据将有助于监管机构制定监管基因组编辑的牲畜的流程。要使这项技术在商业性畜牧生产中发挥作用，适当的监管至关重要。

讨论
研究报告提供了对基因编辑获得PC POLLED无角等位基因纯合子公牛的子代的详细分析。这种有目的性基因编辑涉及在质粒中使用PC HDR模板DNA序列来指导无角基因座上TALEN介导的双链断裂的HDR。测序结果发现基因编辑公牛是复合杂合子，具有一个天然存在的PC等位基因，一个包含供体质粒序列和PC HDR模板重复的等位基因。使用单链寡聚脱氧核苷酸（ssODN）或DNA（ssDNA）修复模板，代替供体质粒，将消除这种质粒主链整合的可能性。正如预测的那样，六个F1子代都从其父系继承了这个显性等位基因，表型为无角。除此之外，在子代的表型或基因组中没有发现任何显著或出乎意料的发现，只有一只小牛隐睾。经基因组编辑的公牛RCI002也具有未降的睾丸。这种特性被称为隐睾症，具有中等遗传力。尽管某些品种（无角 Hereford和Shorthorn）的隐睾症患病风险较高，但尚不清楚无角表型与隐睾症是否有关。

生物信息学分析表明，PC等位基因是稳定遗传的，位于基因组中的预期位置，并且孟德尔错误率在基因组编辑的后代与当代对照之间没有差异。仍然不确定的是，脱靶改变的水平是否可接受的，以及没有明显的方法可以区分意外改变和自发发生的插入，取代，缺失和其他不可预测的自然改变。此外，尚不清楚食用动物中与编辑相关的，无意的，脱靶的DNA改变会带来哪些独特的风险，而天然发生的背景自发性从头突变的发生率甚至可能更高。

由于基因编辑公牛及其部分子代的一个等位基因发现质粒和PC HDR模板序列的插入，虽然并未造成对表型的影响，这一发现
突出了筛选质粒序列的需要。这种筛选通常在植物育种中进行，常规的基因组编辑通常涉及编码编辑成分的DNA盒的传递和整合入宿主基因组。最终的已编辑植物产物通常是含有预期基因组改变但不包含来自编辑盒的质粒DNA。理想情况应在产生动物之前进行质粒序列的筛选。但是，当基因编辑成分通过CPI传递到单细胞受精卵中时，这具有一定挑战性，因为在胚胎转移前进行活检会降低胚胎的生存能力，并且滋养外胚层活检的结果可能无法反映动物的所有细胞。

研究结果与此前其他两项针对食用动物的研究一致——它们研究了基于基因组编辑的（CRISPR / Cas9）绵羊和山羊的全基因组测序。这两篇论文都研究了针对性的基因敲除——其中核酸酶引入了定点双链断裂，该断裂通过细胞固有的DNA修复机制进行修复，因此不涉及HDR质粒。这些涉及父亲/母亲/子代三重测序的分析与先前在人类，猴子和啮齿动物中进行的CRISPR / Cas9脱靶研究一致，表明基因编辑动物中Cas9介导的de novo突变率与平均自发种系de novo突变的比率相比可忽略不计。

还有顾虑担心，基因工程子代可能会在怀孕或生产过程中将外源遗传信息传递给母体，比如担心胎儿细胞会穿过胎盘屏障并留在母亲体内（胎儿-母亲的微嵌合体），因此研究人员将已生出基因工程后代的代孕母牛视为基因工程牛焚化处理，排除了它们进入食物供应的可能性。对于在任何母体中通过qPCR检测的任何基因座，都没有发现任何胎儿微嵌合体的证据。考虑到常规育种可能已经实现的基因组改变，与胎儿微嵌合体相关的危害很难确定。在基因组编辑无角子代的代孕母牛和对照代孕母牛之间没有发现明显差异，也没有迹象表明由于妊娠后代孕母牛发生了任何潜在的、来自经过基因组编辑无角公牛的危险变化。这进一步增加了成本并降低了使用重组DNA技术（包括基因组编辑）进行实验工作的经济可行性。

基因组编辑的出现提供了一个重新思考生物技术产品监管方法的机会，进行额外监管审查的触发因素应该是任何新的产品危害/风险，并权衡由此带来的利益。自2009年以来，FDA已对携带rDNA构建体的基因工程动物作为新的动物药物进行了监管。 到目前为止，只有一种工程食用动物AquAdvantage鲑鱼成功地成功完成了这一多代上市前监管审批程序。这个过程耗时十多年，耗资数百万美元。根据FDA 2017年指导原则草案，基因组编辑动物的开发者应充分表征故意改变和任何意外改变（例如，脱靶改变，意外插入，取代或缺失）的位点，尤其是在编码或调控区域。此外，每种特定的基因组改变都需要文本概述的分析类型，因为“每个特定的基因组改变被认为是需要获得新动物药物批准的独立的新动物药物”。此外，该指南建议开发人员应进行研究，表明基因型改变是持久的，这意味着改变后的基因组DNA是稳定遗传的。对于表型耐久性，建议使用数据显示多代表达的性状的一致性。还建议从至少两个世代（最好是更多世代）收集有关继承的数据，并且至少两个采样点应来自非连续世代（例如F1和F3）。在这项研究中介绍了一代F1的数据。实际上，对具有较长世代间隔的大型牲畜物种（例如牛）的多代研究使得这种研究在时间投资和成本上都异常昂贵，尤其是在不允许后代进入食物供应时。本实验中，经过基因组编辑的公牛出生于2015年4月，四年后才有了F1数据。雌性后代现在已经怀孕，预计在2020年的某个时候能够从她那里收集牛奶。

结果将为基因编辑技术进入动物育种领域带来希望。