不同品牌游离核酸保存管的比较

1.前言

循环游离核酸(circulating cell-free nucleic acids)是指存在于人体循环系统中，游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，包括核DNA、线粒体DNA(mitochondrial DNA，mitDNA)、病毒DNA、信使RNA(messenger RNA，mRNA)及微小RNA(microRNA，miRNA)等。1948年，Mandel等［1］首次发现了血液循环中游离DNA的存在。随后，循环游离核酸在病理状态下的特异性变化引起了广泛关注。虽然这一发现十分重大，但当时并未引起人们的广泛关注，并且在此后的很长一段时间里，人们也仅局限于研究游离 DNA 与人类自身免疫病之间的关系。1975 年，Steinman 在健康人的血浆中也发现有游离形式的核酸存在，这提示我们这种核酸的出现属于病理学事件，而非病因学事件，但健康人血浆中游离 DNA 的量要显著低于患有一定疾病的人。1977年，Leon等［2］发现肿瘤患者血清中的游离DNA水平较健康人群明显升高，并与肿瘤的进展与预后相关。1997年，人们发现在孕妇血浆中含有游离形式的胎儿源的 DNA，这使得血浆游离核酸的研究在胎儿出生前诊断方面的应用也有了快速的发展。1989年，Stroun等［3］发现肿瘤患者血液中的游离核酸含有与肿瘤细胞相同的基因突变。现如今，游离核酸与肿瘤、妊娠相关性疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤、急救医学等有着密切关系，其检测对疾病的早期诊断、分期、监测、预后判断等有重要意义。

鉴于游离核酸的重要检测意义，游离核酸的保存条件则直接决定了检测结果的可靠性。为确保游离核酸标本检测的准确性，本文采用了市面上常用的不同品牌游离核酸保存管，就保存效果进行了比较。

2 材料与方法

2. 1 材料

2.1.1保存管及分组
（1）E组：普通抗凝采血管（主要成分EDTA•2Na）；
（2）S组：Cell-Free DNA BCT（品牌：S公司，REF.2***52）；
（3）B组：Cell-Free DNA Storage Tube 10mL(品牌：百泰克，REF. ST2001)；
（4）K组：Cell-Free DNA Storage Tube 10mL（品牌：K公司，Cat. CW***6S）。

2.1.2血液样本
健康人血10ml。

2.1.3 试剂及设备
（1）Premix EX Taq （TaKaRa,Cat.RR390A）；
（2）探针及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
（3）Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen by Thermo Fisher Scientific）；
（4）Beta-actin质粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成；
（5）BioRad-CFX96(BIO-RAD, Foster city, California，USA），Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies，USA)，Mili-Q Advantage A10，SHZ-82A恒温振荡器（常州医疗器件厂）。

2.2 方法

2.2.1血液样本采集
采用标准静脉穿刺采集年龄22-40岁健康人血10ml，各组年龄差异无统计学意义（P＜0.05），分别装于采血管及保存管。

2.2.2血浆分离方法
轻柔上下颠倒混匀10次，800×g，20min，转移上层血浆至1.5ml离心管；16,000×g，室温，10min，转移上层血浆至1.5ml离心管冻存-80℃备用。提取游离核酸前，室温解冻，16,000×g，5min，吸取上层血浆，进行游离核酸提取。

2.2.3 游离核酸提取方法
根据QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook 试剂盒操作说明操作。

2.2.4 Qubit荧光计定量血浆游离DNA的浓度
采用Qubit 2.0荧光计定量血浆游离DNA的浓度。

2.2.5 Beta-actin拷贝数的检测
Beta-actin 10倍梯度稀释107-101，引物分别分actin-F1，actin-R1，探针为probe actin，引物及探针工作浓度为5 uM，20ul荧光定量体系引物加入量为各1ul。

扩增程序为50°C、5min，95°C、10min，循环50次， 95°C、20s，65°C、20s，72°C、 10min，结束。
 扩增程序试剂组成：

Reagent	体积（ul）
Takara Premix	10
Primer F	1
Primer R	1
Probe	1
模板	1
ddH2O	补足20ul

3 结果

3.1 不同天数下（25°C）游离核酸保存效果的对比

分别用3种不同的保存管（E、S及B）采集血液10ml，颠倒混匀15次后立即等分4份至无抗凝剂无促凝剂的玻璃采血管中，保存条件为25°C。分别于保存第0、3、7、14天时分离血浆，提取游离核酸。

图 1不同保存天数下血液保存现象

图1 显示：保存第7天和第14天，E组出现明显的溶血现象，并随时间的延长更加严重；S品牌产品保存的血液第7天略微有溶血现象，第14天时，溶血严重。相比之下，B品牌产品效果较佳。

 
图 2  Qubit 检测不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml）

图2 显示：25°C条件下，E产品在第0天时，基因组基本无释放；第3、7、14天的核酸量随时间延长，基因组释放量增加明显；第14天的核酸检测量是第0天的至少2500倍。 B产品的保存效果在14天之内，基本能够抑制基因组的释放；第14天的检测结果为第0天的1.77倍。S品牌产品7天之内，能够保持cfDNA稳定，基本无基因组释放；但第14天检测量剧增，是第0天的2200倍。

 
图3 不同保存天数下每毫升血液Beta-actin拷贝数

图3 显示：Beta-actin绝对定量结果趋势与Qubit结果基本一致，室温25°C保存3天，3种保存管的差异不显著；保存第7天时，E与B组间的P Value<0.01，差异极显著，B与S组 0.01<P value<0.05，差异具有显著性；保存第14天时，B与S组P value<0.01，差异极显著。

图4 不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml）

图4Qubit结果显示：三种保存管7天内保存效果无明显差异，14天时，K组与S组保存管均出现明显的上升，分别是第0天的15.27倍和10.21倍，21天时，上升最为明显，分别是第0天的22.46倍和13.84倍。B组保护剂保存的血液在第0、3、7、14、21、28天检测时，每毫升血液cf-DNA浓度均无明显的上升。

图5 不同保存天数下每毫升血液Beta-actin拷贝数

图5Beta-actin绝对定量结果与图4基本一致。B2组保护剂保存的血液在第0、3、7、14、21、28天检测时，每毫升血液Beta-actin拷贝数均无明显的上升。

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3.2 不同天数下（4°C）游离核酸保存效果的对比

 
图6 不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml）

图6 Qubit结果显示：在4°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。

 
图7 不同保存天数下每毫升血液Beta-actin拷贝数

图7 Beta-actin结果显示：在4°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数并无明显的差异。

3.3 不同天数下（37°C）游离核酸保存效果的对比

 
图8 不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml）

图8 Qubit结果显示：在37°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。

 
图9 不同保存天数下每毫升血液Beta-actin拷贝数

图9 Beta-actin结果显示：在37°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数并无明显的差异。

3.4 运输环境（25°C）对游离核酸保存效果的影响

考虑到保存管有可能应用于样品的长途或短途运输，因此需用摇床模拟运输环境对保护剂抑制细胞破裂的影响。S组、K组及B组分别采集血液一份，摇床设置180rpm，25°C，分别在0、3、7、14天检测核酸浓度和beta-actin拷贝量。

 
图10 不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml）

图10 Qubit结果显示：在25°C模拟震荡情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。

 
图11不同保存天数下每毫升血液Beta-actin拷贝数

图11 Beta-actin结果显示：在25°C模拟震荡情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数并无明显的差异。

4.讨论

（1）从每毫升血液Beta-actin拷贝数及每毫升血液cf-DNA浓度两个方面来验证cf-DNA完整性，已在多篇文献中[4][5]得到验证。
（2）室温25°C下，保存3天时，3种保存管的差异不显著；保存第7天时，E与B组间的差异极显著，B与S组差异具有显著性；保存第14天时，B与S组P value<0.01，差异极显著。在室温25°C下，B组较S组及E组，保存时间较长，效果较佳。
（3）室温25°C下，三种保存管7天内保存效果无明显差异，14天时，K组与S组保存管均出现明显的上升，，21天时，上升最明显。B组保护剂保存的血液在第0、3、7、14、21、28天检测时，每毫升血液cf-DNA浓度均无明显的上升。在室温25°C下，B组较S组及K组，保存时间较长，效果较佳。
（4）在4°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数及每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。在4°C下，B组、S组及K组，保存效果无明显差异。
（5）在37°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数及每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。在37°C下，B组、S组及K组，保存效果无明显差异。
（6）在25°C模拟震荡情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数及每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。在25°C模拟震荡情况下，B组、S组及K组，保存效果无明显差异。

5.参考文献

[1]MANDEL P, MÉTAIS P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme ［J］. C R Acad Sci Paris, 1948,142: 241-243.
[2]LEON S A, SHAPIRO B, SKLAROFF D M, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy ［J］.Cancer Res, 1977, 37(3): 646-750.
[3]STROUN M, ANKER P, MAURICE P, et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］. Oncology, 1989, 46(5): 318-322.
[4]Norton S E, Lechner J M, Williams T, et al. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(15):1561-5.
[5] Ryan W L, Fernando R M, Das K. BLOOD COLLECTION DEVICE FOR STABILIZING CELL-FREE PLASMA DNA:, WO 2013123030 A3[P]. 2013.