Stellaris RNA FISH原位验证促进LncRNA功能机制研究

　　

长链非编码RNA（Long Non-Coding RNA, LncRNA），是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，因此一度被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，LncRNA以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控了基因的表达水平，且与多种疾病的发生、性状的表现存在密切的关系。

近来，越来越多的lncRNA被鉴定。有趣的是，其中一些lncRNA展示了细胞类型特异性的表达模式，并被证明在发育过程中发挥关键作用，包括细胞的命运决定、细胞分化、调控细胞周期、细胞增殖、凋亡和衰老。还牵涉到在干细胞中调控多能状态，以及启动分化程序。

在下面这篇文章——Linc-RAM通过与MyoD相互作用增强肌原性肌细胞的分化中，中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院的Xiaohua Yu和 Yong Zhang等人发现并揭示了一种谱系特异性Linc-RAM的功能作用和分子机制，作为一种组织特异性染色质重塑和基因表达的调控lncRNA。

肌细胞生成是一个高度协调的发育过程。肌原细胞的规格和分化是由主转录调控因子MyoD决定的。在这里，研究者报道了一种新型lncRNA，具有调节肌分化因子MyoD，并促进激活肌原程序，也因此命名为Linc-RAM (Linc-RNA Activator of Myogenesis)。Linc-RAM转录自肌原细胞的一个基因间区域，在肌生成过程中它的表达上调。即描述了Linc-RAM的鉴定和表征，它是在骨骼肌组织中特定表达的，并在功能上促进了成肌分化。值得注意的是，在体内功能研究中显示，由于卫星细胞的分化缺陷，Linc-RAM敲除小鼠的肌肉再生能力受损。从机制上讲, Linc-RAM 通过直接结合MyoD来调控肌原基因的表达，反过来又促进MyoD–Baf60c–Brg1复合物的组装。

Linc-RAM增强肌原分化的功能上，实验者发现并支持Linc-RAM在促进肌原细胞分化过程中的功能，是作为一种调控RNA，参与骨骼肌发育过程中肌肉基因表达的转录控制。为了证实这一点，实验者首先检查了Linc-RAM的亚细胞定位，被荧光原位杂交(FISH)实验结果证实。

Subcellular localization of Linc-RAM in differentiated and undifferentiated C2C12 cells (DM 2 days) was examined by RNA FISH using a pool of singly-Cal610-labeld ODN probes against the Linc-RAM (Linc-RAM Probes). A pool of singly-Cal610-labeld ODN probes against the EGFP-coding sequence served as nonsense control (control probes). The nuclei were stained with DAPI. The images are representatives of three independent experiments. Scale bar, 20 mm.

以下这篇同样发表在nature communications上的研究成果是有关于lncRNA与肝癌的。

肝癌趋向于在病人中无症状地发展，因此大多数病人在后期才被诊断出来。越来越多的证据表明，肝脏肿瘤引发细胞(TICs)是导致肝癌形成、转移、耐药和复发的主要原因。然而，肝脏TIC自我更新的分子机制尚不清楚。

在这篇研究中，郑州大学以及郑大**附属医院的Zhen-zhen Chen和Lan Huang等人在肝细胞癌(HCC)组织和肝脏TICs中，发现一种称为LncSox4的长链非编码RNA呈现高度表达，且通过Stat3-Sox4通路启动肝脏TIC的自我更新和肿瘤起始。

LncSox4与 Stat3相互作用，并招募Stat3到Sox4启动子区，启动Sox4的表达。Sox4是肝脏TIC自我更新所必需的。Sox4的表达水平与肝癌的发展、临床的严重程度和患者的预后有关。实验者证明了LncSox4通过Stat3-Sox4通路参与了肝脏肿瘤发生和肝脏TIC的自我更新，从而为根除肝癌提供了一个新的潜在TICs靶点。

通过FISH，LncSox4在肝脏TICs中具有很高的表达水平被鉴定。

High expression of LncSox4 was confirmed by FISH. FITC-conjugated LncSox4 probes and anti-CD133 antibody were used for non-sphere and sphere staining, followed by counterstain with DAPI.

LncSox4和Stat3的相互作用得到了double FISH的证实。在肝脏TICs 中不仅看到了LncSox4的定位，尤其看到了显著的LncSox4的Stat3共定位（如下图）。

LncSox4 is co-localized with Stat3. LncSox4 probes and anti-Stat3 antibody were used to examine the subcellular location using flow cytometer sorted CD133- (Non-TIC), CD133 þ (TIC) cells and stem-like oncospheres (Sphere). Scale bars, 10 mm.

随着近年来转录组研究迅猛，以及高水平杂志对数据准确性的要求越来越高，要确定前期筛选靶标的表达量、分子功能及作用机制，必须经过原位的验证。越来越多的研究者采用RNA FISH，对lncRNA等不表达蛋白的非编码RNA进行原位验证。Stellaris™ RNA FISH是基因有限公司代理的LGC Biosearch公司明星产品，能够实现亚细胞定位和定量lncRNA，观察lncRNA组织特异性表达，并可实现单细胞单拷贝灵敏度！同时非常适合于多重RNA共定位，以及RNA-蛋白共定位。同时具有操作简单、灵敏度高、特异性好且适用性广等优势。

作为设计、开发和生产荧光引物/探针和相关分子诊断试剂的全球领导者，Biosearch的Stellaris RNA FISH技术近年来已得到了越来越多的科研工作者认可，引用的paper超过33%发表于Nature、Science、Cell及其子刊上。

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