辛辛那提大学陈建军教授最新综述：肿瘤m6A研究成果与展望【推荐深读】

　　

m6A作为真核细胞丰度最高的mRNA修饰，已发现在许多正常生物过程中发挥重要的作用，如组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答等。m6A修饰机制在正常生物过程中如此重要，与癌症的发生、发展和药物应答的关系也十分密切。来自辛辛那提大学的陈建军教授上个月在Cell Research上发表了一篇综述，总结了m6A修饰失调与多种肿瘤发病、药物应答相关的病理机制，在此基础上，讨论针对m6A修饰失调的肿瘤治疗药物研发的可行性。文中所引用的都是最新最前沿的研究成果，具有很好的实验设计参考价值。

m6A甲基转移酶复合物由METTL13、METTL14和WTAP组成，可能还包括VIRMA和RBM15，充当m6A writer (书写器)，去甲基化酶 (如FTO, ALKBH5)充当erasers (擦除器)，还有一系列m6A结合蛋白 (YTHDF1/2/3, YTHDC1/2, IGF2BP1/2/3, METTL3和eIF3) 作为 readers (阅读器)，决定m6A修饰的靶mRNA转录本的命运。

FTO与白血病和脑癌

科学家发现，FTO基因位点上的单核苷酸多态性(SNP)和肥胖、糖尿病关系密切，所以FTO在近十年变得很出名。虽然这个结果具有争议性，但是在小鼠模型中，FTO对脂肪量、脂肪生成和体重确实有着重要的调控作用，且人成纤维细胞和血细胞的SNP风险表型与FTO表达上升之间存在着联系。

案例1: Li Z, et al. Cancer Cell. 2017

为了研究FTO对肿瘤的病理作用，研究者分析了几组急性髓细胞白血病(AML)患者大样本的全基因组基因表达数据，发现FTO在AML的某些特定亚型中高表达，包括t(11q23)/MLL-重组、t(15;17)/PML-RARA、FLT3-ITD或NPM1突变。
在体内和体外的功能获得性、缺失性实验中，他们发现FTO表达的增加，使人AML细胞存活率、增殖能力提高，促进正常造血干/祖细胞(HSPC)的癌化，并抑制ATRA诱导的AML细胞分化。重要的是，研究者发现FTO，是作为一个m6A去甲基化酶(demethylase)发挥这个作用的，它能在转录后调控它的关键靶RNA表达。

研究者还进行了全转录组m6A-seq、荧光素酶报告基因和突变实验、mRNA稳定性实验和基因特异m6A-qPCR实验，结果表明FTO通过降低m6A修饰丰度、从而降低靶mRNA转录本的稳定性，负调控ASB2和RARA表达。

R-2-hydroxyglutarate (R-2HG)，在异柠檬酸脱氢酶(IDH)1/2突变后会高表达, 在10–20%的AML患者、~80%的II-III级神经胶质瘤和二级GBM(多形性胶质母细胞瘤)中均能发现。最近，通过对27种人白血病细胞系、15个原发性AML样品和8种人GBM细胞系进行分析，研究者发现R-2HG 在白血病和神经胶质瘤中有着广泛的抗肿瘤活性，能降低细胞迁移率/增殖能力，增加细胞周期阻滞(cell-cycle arrest)和凋亡：

案例2: Su R, et al. Cell. 2018

研究者建立了三种动物模型，鉴定得其中2种为R-2HG敏感型；经过不同方式的R-2HG处理，敏感型小鼠的存活率显著延长；随后，研究者再对不同的白血病细胞株进行RNA-seq分析，发现FTO在敏感性细胞中的表达显著上调，并且对敏感型细胞的RNA-seq，发现MYC、G2和E2F的基因表达也会被R-2HG抑制。在机制方面，研究者通过DARTS实验、CETSAs实验和shRNA干扰证实FTO是R-2HG的直接靶点，介导R-2HG诱导的抗肿瘤作用。

研究者还对FTO相关的92个转录因子进行分析，筛选出异常高表达的CEBPA基因，高表达的CEBPA能激活FTO 启动子，而R-2HG可以使CEBPA mRNA的m6A修饰增加，降低转录稳定性，减少其表达。结合此研究结果和其他发表的文章，研究者猜测IDH突变癌症中的内源R-2HG很可能通过抑制TET2和其他表观通路促进癌症的起始。

FTO作为m6A擦除器，对肿瘤起着关键的促进作用，而R-2HG可以抑制它这个功能。a, FTO与AML；b. R-2HG靶向FTO/m6A/MYC/CEBPA轴，在白血病和脑肿瘤中显示出抗癌作用。

ALKBH5与脑癌和乳腺癌

ALKBH5是第二种被发现的m6A去甲基化酶。何川和合作的研究团队发现，ALKBH5会影响mRNA的产出以及RNA代谢，通过p53信号通路调控小鼠精子发生和凋亡。在2017年底，有文章报道ALKBH5作为GBM和乳腺癌病理中的肿瘤蛋白，影响着这些肿瘤干细胞的自我更新和增殖：

案例3: Zhang S, et al. Cancer Cell. 2017

该研究发现，ALKBH5的表达在胶质瘤干细胞样细胞(GSCs)中异常上调，这种高表达与GBM患者的不良预后相关。细胞和体内实验表明，沉默ALKBH5能降低GSC细胞的自我更新能力且抑制GSC增殖/抑制肿瘤生长。随后，研究者利用meRIP鉴定m6A RNA甲基化修饰模式，联合基因芯片检测差异表达＞2倍的基因，最终筛选到与胶质瘤增殖相关的转录因子FOXM1，是ALKBH5的靶基因；再通过qPCR、WB、免疫荧光、核质分离WB/qPCR、RIP和MeRIP等实验证明ALKBH5使FOXM1转录本去甲基化，增加FOXM1表达；此外，FOXM1反义lncRNA(FOXM1-AS)还能促进FOXM1与ALKBH5的相互作用。(详细解读请点击此处)

同时也有报道称缺氧刺激HIF1α和HIF2α促进ALKBH5在缺氧的乳腺癌细胞中表达，ALKBH5高表达可通过促进m6A去甲基化，提高mRNA稳定性和NANOG的表达4。

ALKBH5在脑癌和乳腺癌中起着致癌作用。a. ALKBH5增强GSC细胞的自我更新和增殖，在FOXM1-AS的帮助下，通过调控FOXM1表达，促进肿瘤发生；b. HIF诱导的ALKBH5表达，参与上调多能因子表达和BCSC在缺氧环境的富集。

METTL3/14与正常和恶性造血作用

METTL14和METTL3是m6A甲基转移酶复合体的两个主要组件。

案例5: Weng H, et al. Cell Stem Cell. 2017

研究者发现METTL14在HSPC细胞以及携带有t(11q23)、t(15;17)或者t(8;21)的AML细胞中高表达，而在髓系分化的过程中下调，敲除METTL14则会促进正常的HSPC和AML细胞终末髓系分化，并且能够抑制AML细胞的存活/增殖。在机制上，METTL14通过m6A修饰调节其靶基因（如：MYB，MYC）发挥致癌作用，并在蛋白质水平受SPI1的负调控。METTL14在AML疾病以及白血病干/起始细胞（leukemia stem/initiation cells，LSCs/LICs）的发展以及维持过程中必不可少。总之，该研究揭示了SPI1-METTL14-MYB/MYC信号轴在髓细胞和白血病中的作用，并强调了METTL14调控m6A修饰在正常和恶性造血中的关键作用。

前段时间，有报道表明METTL3控制着哺乳动物正常造血细胞和白血病细胞的髓系分化6。METTL3的表达上升，显著促进人脐带血来源的CD34+ HSPC增殖，并抑制其分化。与正常的HSPC或其他癌症相比，METLL3在AML中表达更高。

最近另一项研究也证实METTL3是维持骨髓性白血病状态的关键。Barbieri等人发现7，METTL3和METTL14均可以与染色质结合，主要定位于不同的编码基因的转录起始位点(TSSs)，特征是有H3K4me3双峰。METTL3的募集，靠的是CEBPZ，即一种CCAAT-box结合因子。与启动子结合的METTL3是相关转录本m6A修饰所需的，它可以调控它们的翻译。

METTL14和METTL3促进白血病发生。a, METTL14在AML发展过程中是必需的，它通过m6A依赖机制，调控关键靶基因表达(如MYB和MYC)；b, METTL3促进AML细胞增殖，并抑制髓系分化，这可能是通过促进潜在mRNA靶标的翻译实现的(如MYB和BCL2)；c, METTL3被CEBPZ募集到靶基因的TSS，它的潜在直接靶基因是SP1和SP2，它们可调控MYC的表达。

METTL3/14与GBM和肝癌

Cui等人报道称METTL3的过表达显著促进GSC的分化8，同时抑制其自我更新和增殖，与m6A GSC分化过程中m6A水平上升的影响一致。一些GSC相关的基因是m6A修饰的特定靶基因，可通过控制m6A书写器和擦除器，影响表型。但同时也有另外一个研究团队报道了GBM的METTL3有着相反的功能9：METTL3在GSC中高表达，但是在分化的过程中下调，这与分化时m6A的水平下降有关。动物实验和GBM患者临床数据分析表明，METTL3在GSC的维持和辐射抵抗方面起着关键的致癌作用。

Ma等人报道METTL14充当着肿瘤遏制物的作用10。他们对130个HCC患者样本进行分析，发现METTL14的表达下降与患者不良预后有关。而Chen等人报道HCC中的METTL3水平和METTL14水平均比正常组织高11；对TCGA HCC的数据分析发现METTL3水平提高与患者不良预后有关。经过体内和体外实验，他们证明METTL14和METTL3在HCC的生长和转移方面起着促进作用。

METTL3与肺癌

METTL3被报道在肺腺癌中上调12，促进肺癌细胞的生长、存活与侵袭。有趣的是，这项研究表明METTL3可能作为一个在细胞质m6A阅读器，通过与翻译起始机制相互作用，促进靶标mRNA转录本的翻译。不过，METTL3的催化活性可能仍然是它促进含m6A的靶标转录本所需的，因为它的靶点在细胞质加强翻译之前，需要在细胞核中添加m6A修饰。

 METTL3对肺癌的促进作用。METTL3通过促进靶mRNA转录本的翻译，增强肺癌细胞的生长、生存和侵袭 (如EGFR和TAZ)。

IGF2BP促进癌症发生

直到目前为止，被报道得最多的m6A读写器是YTH结构域蛋白，包括YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, YTDHDC1和YTHDC2。其中，YTHDF2、YTHDF3和YTHDC2促进m6A修饰mRNA的降解。有趣的是，近来研究发现白血病细胞中1，大部分mRNA转录本的m6A丰度因为FTO的过表达而显著下降，mRNA表达有下降趋势，这有可能是由于m6A丰度下降，使RNA稳定性下降。所以研究者推测，某些m6A阅读器可促进mRNA稳定性。

无独有偶，通过m6A-oligo-pull down/质谱分析和m6A结合蛋白预测分析，杨建华教授和陈建军教授合作研究团队最近证实IGF2BP1/2/3是一种新的m6A阅读器家族，可选择性识别m6A修饰（详细解读请点击此处）。

 IGF2BP1/2/3蛋白促进癌症。IGF2BP1/2/3蛋白通过转录后调控关键靶mRNA的稳定性和翻译(比如MYC)，促进癌症细胞增殖、迁移和侵袭。

总结

上述的m6A修饰及其相关的调控蛋白在多种肿瘤起着关键的作用新研究进展，整理如下表：

在这些研究中，IGF2BP蛋白相关研究着实是一个重大的发现：IGF2BP蛋白有选择性地识别并结合到m6A修饰的MYC mRNA CRD区域，从而稳定MYC mRNA并促进翻译；相反，YTHDF2有选择性地识别并结合到m6修饰的5’端以及MYC mRNA中间外显子，从而促进mRNA降解。

在未来的研究中，研发更多FTO及其他m6A调控蛋白的选择性抑制剂，可能有助于研发针对各种癌症的有效治疗方案。特别是将这些抑制剂和其他治疗药物联合使用，可能治疗目前对有效药物耐药的癌种。事实上，研究者已经发现R-2HG和标准治疗药物（比如ATRA、AZA、地西他滨和柔红霉素）有着协同作用。因此，研究不同癌种的不同组合用药效果是很重要的，可通过精准治疗，实现最优的治疗效果，最小的副作用。

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原文: Deng X, et al. RNA N6-methyladenosine modification in cancers: current status and perspectives. Cell Research (2018) 0:1–11.

参考文献:
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1. Li, Z. et al. FTO plays an oncogenic role in acutemyeloid leukemia as a N6-methyladenosine RNA demethylase. Cancer Cell 31,127–141 (2017).
2. Su, R. et al. R-2HG exhibits anti-tumor activity bytargeting FTO/m(6)A/MYC/ CEBPA signaling. Cell 172, 90–105 (2018). e123.
3. Zhang,S. et al. m6A demethylase ALKBH5 maintains tumorigenicity of glio- blastomastem-like cells by sustaining FOXM1 expression and cell proliferation program.Cancer Cell 31, 591–606 (2017). e596.
4. Zhang, C. et al. Hypoxia induces the breast cancer stem cell phenotype by HIF- dependent and ALKBH5-mediated m6A-demethylation of NANOG mRNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 113, E2047–E2056 (2016).5. Weng, H. et al. METTL14 inhibits hematopoietic stem/progenitor differentiation and promotes leukemogenesis via mRNA m(6)A modification. Cell Stem Cell 22, 191–205 (2018). e199.
6. Vu, L. P. et al. The N6-methyladenosine (m6A)-forming enzyme METTL3 controls myeloid differentiation of normal hematopoietic and leukemia cells. Nat. Med.23, 1369–1376 (2017).
7.Barbieri, I. et al. Promoter-bound METTL3 maintainsmyeloid leukaemia by m(6) A-dependent translation control. Nature 552, 126–131(2017).
8. Cui, Q. et al. m6A RNA methylation regulates theself-renewal and tumorigenesis of glioblastoma stem cells. Cell Rep. 18,2622–2634 (2017).
9. Visvanathan, A. et al. Essential role of METTL3-mediated m(6)A modification in glioma stem-like cells maintenance and radioresistance. Oncogene 37, 522–533 (2018).
10.  Ma, J. Z. et al. METTL14 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N(6) -methyladenosine-dependent primary microRNA processing. Hepatology 65, 529–543 (2017).
11. Chen, M. et al. RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2. Hepatology (2017).
12. Lin, S. et al. The m(6)A methyltransferase METTL3 promotes translation in human cancer cells.Mol. Cell. 62, 335–345 (2016).