水稻所胡培松和魏祥进组：水稻叶绿体热胁迫下生物合成必需蛋白质的研究

　　

叶绿体是高等植物中特定的细胞器，负责光合作用和其他重要的代谢途径。作为半自主的细胞器，每个叶绿体含有〜100-250个基因，编码与光合作用或质体基因转录相关的蛋白。被子植物中的质体基因主要由两种类型的RNA聚合酶转录：核编码的RNA聚合酶（NEP）和质体编码的RNA聚合酶（PEP）。NEP主要负责质体管家基因的精确转录，包括PEP核心亚基和参与基础质体功能的基因。PEP驱动叶绿体所必需的光合基因转录，并且负责成熟叶绿体中超过80％的原生质体转录物。

PEP复合体由四个质体编码的核心亚基（rpoA，rpoB，rpoC1和rpoC2）和几种核编码的蛋白质如σ因子和聚合酶相关蛋白（PAPs）组成。rpo亚基产生核心复合物，其被另外的蛋白质如PAPs等包被构建更大的叶绿体特异性PEP复合物。

研究表明，PAPs可影响PEP复合物的活性和完整性，以进一步调节叶绿体转录机制。此外，PAPs的一些调节蛋白可通过PEP介导的基因转录。目前，在拟南芥中鉴定出12种不同的PAPs，但关于叶绿体中转录过程的研究，尤其是PEP复合体功能研究，在水稻等重要作物中受到明显限制。因此，揭示水稻PEP复合体中蛋白质的精确功能具有重要意义，有助于更好地理解水稻叶绿体生物合成和高效光合作用系统。

本研究中，中国水稻研究所胡培松和魏祥进研究团队以水稻叶片为研究对象，利用图位克隆，RNA-Seq，GUS组织化学测定，WLP2亚细胞定位，酵母双杂交实验，双分子荧光互补检测，体外pull-down分析及western blots，qRT-PCR等技术鉴定了一种新的PEP相关蛋白（PAP）——WLP2。

材料：甲基磺酸乙酯（EMS）诱导产生的wlp2s和wlp2w突变体；wlp2s和籼稻杂交的F2代用于基因定位。

本研究基于水稻两个等位基因白叶和圆锥花序突变体wlp2s和wlp2w鉴定了一种新的PEP相关蛋白（PAP）——WLP2。这两个突变体在高温下具有白化致死性，叶绿素积累减少，叶绿体超微结构异常，光合作用减弱的特征。图位克隆表明WLP2可能编码pfkB型碳水化合物激酶家族蛋白，其在拟南芥中与类果糖激酶1（AtFLN1）同源。 WLP2主要在绿色组织中表达，其蛋白定位于叶绿体中。在wlp2突变体中，PEP编码基因，叶绿体发育基因和光合作用相关基因的表达水平受损，表明WLP2对于正常叶绿体生物合成是必需的。此外，WLP2及其旁系同源OsFLN2可与硫氧还蛋白OsTRXz产生物理相互作用形成TRX-FLN调控模块，该模块不仅调控PEP编码基因的转录，而且可在热胁迫下维持叶绿体中的氧化还原平衡。另外，wlp2w突变基因在提高种子纯度和高通量育种方面具有潜在优势。

图 WLP2，OsFLN2和OsTRXz在PEP复合体中形成TRX-FLN调控模块

（A）在酵母双杂交实验中WLP2，OsTRXz和OsFLN2的相互作用。
（B）双分子荧光互补实验显示OsTRXz可以与水稻原生质体细胞中的WLP2和OsFLN2相互作用。
（C）WLP2，OsFLN2和OsTRXz的体外pull-down实验。
（D-F）常温（26℃）或高温（32℃）条件下WLP2（D），OsFLN2（E）和OsTRXz（F）的mRNA水平。
（G）在三叶期幼苗，常温（26℃）或高温（32℃）条件下野生型（WT），wlp2突变体和WLP2过表达系16（OE-16）中OsTRXz的免疫印迹分析。

本研究基于图位克隆技术鉴定了一种新型PAP——WLP2。WLP2突变体在高温下表现出白化致死性并伴随活性氧（ROS）产生增加。PEP介导的基因在叶绿体生物发生过程中的转录水平显著降低，表明WLP2参与水稻叶绿体发育过程中PEP介导的基因转录的调节和热应激反应，并且WLP2在水稻中可以通过TRX-FLN调控模块来保护热应激条件下叶绿体的发育。

参考文献
Lv Y, Shao G, Qiu J, et al. White Leaf and Panicle 2, encoding a PEP-associated protein, is required for chloroplast biogenesis under heat stress in rice.[J]. Journal of Experimental Botany, 2017.

本研究中的RNA-Seq由联川生物提供

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