站在前人的肩膀上 CRISPR再获重要突破：一次切割，纠正上千种突变

　　

UT西南医学中心的一项最新成果研发了一种新的CRISPR基因编辑技术，通过在患者DNA的关键点上进行单次切割，可以纠正引发杜氏肌营养不良症（DMD）的3,000种突变中的大多数突变。

这种方法成功地在患者的心肌细胞中进行了检测，为针对每个引发DMD的基因突变的单个分子治疗方法提出了有效的替代方案，也为其他疾病开辟了新的治疗途径，迄今为止，这些疾病还是需要侵入性方法来纠正单基因突变。

科学家表示，这一新方法提高了人类基因组编辑的准确性，纠正了引起破坏性疾病的DNA序列错误。这一研究成果公布在Science Advances杂志封面上。

UT西南大学Hamon再生科学与医学中心主任Eric Olson博士说：“这是一项重要的进步。我们希望这种技术最终能够减轻DMD患者的痛苦苦，甚至挽救生命。”

CRISPR技术改进
 
杜氏肌营养不良DMD是最常见的致死性儿童遗传病，由于缺乏抗肌萎缩蛋白（dystrophin），肌肉不断退化脱力，患儿早年发病后逐渐失去运动能力，通常将在20岁左右死于心脏或呼吸衰竭。目前还没有办法逆转或治愈这种疾病。

DMD由单个基因中的突变引起，这使其登上基因治疗的候选名单。然而，dystrophin基因是最大的人类基因之一，长达2300 kb，有79个外显子，因此，传统的基因治疗方法束手无策，根本不可能将巨大的dystrophin基因包装到小小的病毒载体中。

为此当CRISPR登场时，科学家们就想到了利用这种技术来治疗DMD：2014年，UT西南医学中心的Eric Olson团队就使用CRISPR来纠正了DMD小鼠模型中的dystrophin突变。其后在2016年，2017年，Olson博士一直都在进行着技术改进，他们探索了多种可能性，比如利用腺相关病毒（AAV）载体将CRISPR元件导入DMD小鼠模型，删除错误的外显子，并去除一个移码突变。他们在幼鼠出生后的不同时间导入载体，发现每种方法都能够恢复dystrophin蛋白表达，增强心脏和骨骼肌的功能。

踩在这些研究的基石上，最新这一技术实现了导致DMD3,000种类型突变中大多数突变的纠正。而且只需要在患者DNA关键点进行一次切割，这比传统的基因编辑方法更少伤害。

研究人员开发出了12种导向RNA，用于发现沿着肌营养不良蛋白基因的突变“hotspots”，帮助将人心脏肌肉组织中的心脏功能恢复到接近正常水平。

这项研究表明，通过消除基因组DNA中的异常剪接位点，可以在人类细胞中修正大范围的突变。这些剪接位点会指导遗传机器构建异常肌营养不良蛋白分子，如果能成功编辑基因，就能表达改善后的蛋白产物，增强肌肉组织的功能。

新的CRISPR-Cas9基因编辑技术改善了DMD患者的心肌细胞功能。从左到右，这些镜头显示了健康的心肌组织，DMD心肌组织和由CRISPR-Cas9编辑的心肌

“实际上，我们发现纠正不到一半的心肌细胞基因，就足以在人体工程学上将心脏组织中的心脏功能恢复到接近正常水平。”文章的第一作者Chengzu Long博士说。

精确编辑
 
Olson博士研究组花费了大量的时间开发和检测各种导向RNA，将Cas9酶精确导向12个指定的剪接位点并避免错误编辑。这些位点都是有针对性的，因为它们位于沿着dystrophin基因的“hotspots”，沿路上高达60％会发生致病突变。

“这是一个新的概念，”文章的另外一位作者，分子生物学教授Rhonda Bassel-Duby博士说，“我们不仅找到了治疗许多突变的实用方法，而且开发出了一种更少侵入的方法，可以跳过有缺陷的DNA而不是去除它，基因组结构性非常强，其实不需要去除可能很重要的DNA ”。

单切编辑策略可能对治疗其他单基因疾病也有用，Olson博士说。不过如果从蛋白翻译序列中去除某些外显子，那么所涉及的基因必须能够起作用。

“肌营养不良症就像一个大的减震器，去除一些弹簧圈可以，但要去除其它蛋白也许就不是那么容易了。”

“真正的希望”
 
接下来，研究人员将会继续测试这种方法，确保它不会出现不良的副作用，同时也会寻找提高导向RNA精度的方法。

与此同时，一家新的生物技术公司Exonics Therapeutics Inc.，也成立了，这家公司致力于进一步优化和扩大更多DMD突变以及其他神经肌肉疾病的治疗方法。 Exonics已经获得了UT 西南中心的技术许可。

Bassel-Duby博士说：“这是一巨大的进步，我们提出了许多不同的疗法，但是这个疗法为延长和改善患者生活质量带来了真正的希望。”

一些患者已经利用这种方法，纠正了细胞中的缺陷。文章的另外一位作者Jay Schneider博士回忆说，几年前第一个捐赠细胞的DMD患者，当他坐在轮椅上进入实验室时，惊讶地看着自己的肌肉细胞进行了纠正性编辑之后敲打培养皿。

“这不仅对于这个病人，而且对整个临床和科学团队来说，都是一个令人难以置信的时刻，”Schneider博士说，“把DMD这样的医疗问题从患者身上带到实验室，然后再回到患者身上。这种新的基因编辑技术正在使这一愿景变成现实。”

（生物通：万纹）

原文标题：

Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing