PNAS：首次发现肺泡一型细胞存在两种细胞亚型

这项研究首次阐述了肺泡一型细胞在肺泡发育和肺泡再生过程中的异质性。

　　

北京生命科学研究所汤楠实验室在《PNAS》杂志在线发表了题为“The pulmonary alveolar type I cell population consists of two distinct subtypes that differ in cell fate”的研究论文，首次阐述了肺泡一型细胞在肺泡发育和肺泡再生过程中的异质性。

上图是在成年小鼠肺中由Igfbp2-CreER 谱系标记的表达膜GFP的单个肺泡一型细胞 （王艳杰提供）。这种细胞大而平，细胞膜有很多分支，这样的结构有利于与周围细胞建立紧密连接。细胞上有很多大小不一的孔 （Khon孔）。Khon孔的形成机制和功能还有待研究。

 目前，我们已熟知肺泡一型细胞是肺泡上皮细胞的一种。但在60多年前，关于是否存在肺泡上皮细胞，科学界是存在巨大争论的。当时更为流行的观点是，气体交换表面仅由毛细血管组成。直到1952年，通过应用电子显微镜，科学家们才首次在大鼠肺组织中发现了肺泡 (lymphatic endotheia中存在中存在中两种上皮细胞：一型细胞（AT1）和二型细胞（AT2）。因此，才提出了气血屏障由内皮细胞和肺上皮细胞共同构成的理论，并开始了针对肺泡上皮细胞的研究。

1952	电镜发现肺泡上皮细胞，AT1和AT2 细胞 (Low FN, et al)
1996	PDPN (William MC, et al)，在出生前和出生后的AT1细胞都有表达.
1997	AQP5 (Nielsen S, et al)，在出生前和出生后的AT1细胞都有表达
2004	AGER (Dahlin K, et al), 在出生前和出生后的AT1细胞都有表达
2013	HOPX (Barkauskas CE, et al), 在出生前和出生后的AT1细胞都有表达
2016	AT1细胞不是终末分化细胞 (Jain R, et al), HOPX+ AT1细胞有可塑性
2018	IGFBP2 (Wang Y, et al), 只在出生后的AT1细胞里有表达

此表总结了自发现至今的60多年里，关于AT1细胞的一些重要发现。

自发现肺上皮细胞至今的60多年里，肺泡AT2细胞的代谢和功能已被科学家们较深入地进行了揭示。尽管大家都知道AT1细胞对于肺的气-血屏障功能尤为重要,在肺疾病中也更容易被损伤，但是对AT1细胞的研究却依然表浅，对AT1细胞的分子遗传学特征及异质性就更是知之甚少。这本身也阻碍了对AT1细胞的进一步研究。例如，传统认为AT1细胞被看作是终末分化的细胞。而最近一项研究发现，成年AT1细胞可能保留了细胞可塑性，能够在肺切除诱发的肺泡再生中增殖并产生AT2细胞。但这个令人兴奋的发现却也在领域里引起了争论。究其原因，还是因为领域里缺乏关于AT1细胞发育和异质性的认识，因此并不知道是全部或是仅有一部分AT1细胞能够转分化成AT2细胞。  

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那么，为什么人们对AT1细胞的认识依然表浅呢？这里面有两个主要原因：  

1. 分离AT1细胞有很大的技术挑战。首先，AT1细胞数量少， (lymphatic endotheia虽然AT1细胞覆盖了95％～98%以上的肺泡表面，但仅占肺里细胞总数目的10% (甚至更少)。其次，AT1细胞很大，难于从组织中消化分离。另外，AT1细胞又很薄很脆，容易破碎，进一步增加分离时的难度。

上图是成年小鼠肺泡AT1细胞的电镜图 （姜克武提供）。电镜发现人和小鼠的肺泡AT1细胞最薄的地方只有40-50nm, 这样的细胞结构有利于气体有效地扩散到血管。

 

2. 无特异性标记物，分选难度很大。已往发现的AT1细胞标记物都不足够特异, 也就是在肺中其他细胞也有表达。例如：PDPN，作为AT1细胞的标记物，在肺脏的基底细胞 (basal cells)、淋巴管上皮细胞 (lymphatic endothelial cells)以及间皮细胞 (mesothelial cells)中都有表达。同样，AQP5在内皮细胞 (endothelial cells)和AT2细胞中也有表达。AGER在AT2细胞中也有表达。这样，想要分选纯度比较高的AT1细胞就十分困难。

汤楠实验室的研究者将单细胞测序，小鼠遗传学和肺泡小体器官培养等技术相结合，第一次探究了在肺泡发育和再生过程中，AT1细胞在转录组水平上的变化，并因此发现了一个新的AT1细胞遗传分子标记物，即胰岛素样生长因子结合蛋白2（Igfbp2）。同时研究者也证实了Igfbp2在人的肺脏中也特异地在AT1细胞表达。

上图介绍研究者在出生后小鼠的不同发育阶段将AT1细胞分选出来进行单细胞测序。

 令人惊讶的是,在小鼠出生后Igfbp2才开始在AT1细胞里表达。利用该分子标记物，研究者发现出生后AT1细胞存在着两种细胞亚型：Igfbp2+Hopx+的AT1细胞和Igfbp2-Hopx+的AT1细胞。在新生小鼠的AT1细胞和再生新肺泡的AT1细胞中，Igfbp2表达不均一，随着肺泡发育和损伤后的恢复，Igfbp2阳性AT1细胞的比例逐渐增加。同时，研究者发现Igfbp2+Hopx+ AT1细胞是终末分化细胞，在正常发育或损伤后的肺再生中，Igfbp2+Hopx+ AT1细胞不能再转分化成AT2细胞。该研究结果支持在肺泡再生过程中，AT2细胞分化成AT1细胞过程中有个“非成熟”阶段，在这个阶段“非成熟”的AT1细胞有细胞可塑性，在损伤等特定地条件下可以转分化为AT2细胞。

上图显示刚出生（Postnatal day 0_P0)小鼠的肺泡AT1细胞不表达IGFBP2。 随着发育，肺泡里表达IGFBP2的AT1细胞比例逐渐增加。在60天的小鼠肺里，95%的AT1细胞表达IGFBP2。

 

上图显示在肺切除诱导的肺泡再生中，从AT2细胞新分化成的AT1细胞表达一些传统的AT1 细胞marker，比如Hopx,但在再生的初期 （day 14)并不表达IGFBP2 （F，被膜GFP标记的AT1细胞是新从AT2细胞分化来的AT1细胞）。随着分化的AT1细胞的“成熟 ”(day 45)，这些新的AT1细胞开始表达IGFBP2 （G and H）.

 

这项研究为将来研究肺泡AT1细胞在肺泡再生和疾病进程中的作用提供了重要的研究基础,为AT1细胞命运的调控机制研究提供了工具和研究方向。另外，基于此研究，还有很多重要的问题值得去探索，比如，“成熟”的AT1细胞到底和“非成熟”的AT1细胞到底有什么不同？调控AT1细胞成熟的分子机制是什么？越来越多的证据表明AT1细胞不只具有被动的气体交换功能，AT1细胞会主动参与到肺再生和疾病的修复过程。未来汤楠实验室会继续推进对肺泡AT1细胞的细胞学和生理学研究。  

汤楠实验室PTN项目博士生王艳杰为第一作者。该论文的其他作者还包括汤楠实验室汤赞、李蛟、王诤、于元元和李娟，核酸测序中心的黄焕伟，转基因中心的王凤超博士，北京武警总医院的张成伟博士，中日友好医院的代华平博士。汤楠博士和蔡涛博士为共同通讯作者。该研究由北京市科委基金和中国国家重点研究与发展项目资助，在北京生命科学研究所完成。

原文标题：

The pulmonary alveolar type I cell population consists of two distinct subtypes that differ in cell fate