Nature Methods：直接测序RNA的新方法

　　

生物通报道  《Nature Methods》上最新发表的一项研究表明，纳米孔测序技术可实现RNA直接测序，产生实时的序列数据，无需逆转录或扩增，从而避免引入偏倚。这是目前第一种真正直接的RNA-seq方法。

细胞的转录组蕴含了丰富的信息，包括基因的结构、转录本的表达水平和反义转录。捕获这些信息的最好方法是准确、定量地揭示碱基的存在和身份，而不需要预先知道序列。当然，这种方法最好能生成跨越剪接点的连续序列。

目前最常用的RNA-seq策略是利用poly(dT)引物或随机六聚体引物进行cDNA合成。之后再通过PCR来扩增这些cDNA链，不过这可能会降低cDNA文库的复杂性，影响cDNA的相对丰度，并造成某些种类的RNA丢失。此外，在PCR扩增过程中，RNA的所有修饰都会丢失。

现在有两种方法在制备RNA-seq文库时不需要PCR扩增。它们分别是Illumina平台上的FRT-seq技术和Helicos平台上的DRS技术。不过，这两种方法都产生短序列，这使得人们难以正确鉴定真核生物中的选择性剪接。

为此，Oxford Nanopore公司的研发人员利用纳米孔测序平台，开发一种高度并行的单分子RNA-seq方法，绕过逆转录和扩增步骤，同时能够检测RNA修饰。这种纳米孔测序平台是在RNA分子穿过纳米孔时检测它们，而不需要酶促合成反应。

（图片来自Nature Methods）

随后，研究人员利用MinION测序仪和R9.4流动槽，对酵母poly(A)+ RNA开展直接RNA测序。他们还利用MinION cDNA流程和Illumina 100 bp双端测序流程对相同的样本进行测序。他们发现，直接RNA的数据和cDNA的数据有着最高的相关性，同时两种纳米孔数据与Illumina数据的相关性类似。此外，直接RNA测序的基因覆盖度与Illumina的结果非常吻合。

作者认为，与其他RNA-seq策略相比，直接的RNA-seq方法有许多潜在优势，包括：它无需扩增，不会存在PCR或逆转录的偏倚；产生非常长的序列，对剪接变体的研究特别有用；直接测定RNA，可检测核苷类似物；它是链特异性的。不过，他们也认为这种方法需要进一步改进，以便提高碱基检出的准确性并兼容降解的RNA。（生物通 薄荷）

原文检索

Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores

Nature Methods
doi:10.1038/nmeth.4577