Nature发布癌症免疫研究重大成果：CRISPR筛选发现免疫治疗的奥秘

为什么一些患者能对免疫检查点抑制治疗产生应答，一些患者却不能呢？来自美国国家癌症研究所（NCI）的一组研究人员通过全基因组CRISPR大规模筛选，发现肿瘤中表达特定蛋白编码基因的患者就能对这种癌症免疫疗法做出应答。

　　

设计基于CRISPR的筛选思路。上图为抗肿瘤T细胞杀死靶细胞；下图为靶基因被破坏，导致清除肿瘤的T细胞细胞毒性下降或者消失。

生物通报道：免疫检查点抑制剂是一种新型的癌症药物，目前已被批准用于治疗晚期黑色素瘤患者，以及患有某些肺部，膀胱，头颈部，肾脏和其他类型晚期癌症的患者。一些患者在进行此类治疗的时候疗效不错，缓解期延长，但一些患者情况却不佳。

这是为什么呢？来自美国国家癌症研究所（NCI）的一组研究人员通过全基因组CRISPR大规模筛选，发现肿瘤中表达特定蛋白编码基因的患者就能对这种癌症免疫疗法做出应答，这也就是说一些癌基因是免疫检查点抑制剂治疗方法的必需元件。

这一研究成果公布在8月8日的Nature杂志上，张锋也参与了该项研究。

约翰霍普金斯大学癌症免疫治疗研究所主任Drew Pardoll（未参与该项研究）表示，“这是CRISPR文库筛选技术的一项新颖应用。这项研究验证了肿瘤对免疫疗法做出应答的基因，而且也提出一些意想不到的，有趣的新基因。”

CRISPR筛选技术

作为一种强大的基因组编辑工具，CRISPR-Cas9系统已经迅速发展成为大型的、基于功能的哺乳动物细胞筛选策略。这种新型基因文库是通过单导向RNA（sgRNA）集合的慢病毒传递而构建，指挥Cas9或者抑制dCas9与效应物融合，来研究基因的功能或调节靶细胞的基因转录。与RNA干扰（RNAi）筛选相比，CRISPR-Cas9系统不论在功能缺失还是功能获得筛选中，都表现出更高水平的有效性和可靠性。不同于RNAi策略，一个CRISPR-Cas9文库可以靶定蛋白质编码序列和调控元件，包括启动子、增强子和转录microRNAs和长非编码RNAs的元件。这种强大的遗传工具，无疑将加速各种生物过程的机理发现。

在这篇文章中，研究人员希望能确定哪些基因突变，会导致患者对免疫检查点抑制疗法产生抗性，这些基因在功能上也是促进T细胞对肿瘤细胞的识别。为此，NCI的Nicholas Restifo等人构建了包含十万多个导向RNAs的CRISPR-Cas9文库，这些导向RNAs能靶向人类黑素瘤细胞中的蛋白编码基因。

之后研究人员分析了当肿瘤细胞携带一种单一突变时，是否能被人体CD8+ 效应T细胞杀死，CD8+ 效应T细胞是一种在免疫检查点抑制剂疗法中被激活的免疫细胞，研究人员通过基因工程，使其能表达一种重组的T细胞受体（具有黑素瘤细胞上的抗体特异性，也就是所谓的新抗原）。由此研究人员发现了对于T细胞介导的肿瘤干扰具有重要意义的554个候选基因，这些基因如果在肿瘤细胞中发生突变，就会通过激活T细胞而产生免疫疗法抗性。

这是什么基因？

通过进一步分析，研究人员还发现这554个基因中有13个是由T细胞分泌的细胞因子：γ干扰素诱导的，之前的研究表明γ干扰素能增强T细胞寻找肿瘤细胞靶标的能力。加州大学洛杉矶分校肿瘤免疫学项目主任Antoni Ribas认为，这些研究结果支持了他的研究团队和最近另一个关于CRISPR小鼠筛选的研究发现，即γ干扰素在抗肿瘤免疫应答通路中具有重要作用。

今年7月，Ribas等人首次探明了晚期黑色素瘤是如何对免疫疗法产生耐药性的，他们指出一个称为B2M的基因（编码抗原提呈蛋白β2-微球蛋白，antigen-presentingproteinbeta-2-microglobulin）改变了免疫系统识别癌细胞的方式。同时另外一组利用CRISPR-Cas9开发了一种新的筛选方法，可用于检测小鼠中数以千计肿瘤基因的功能。通过这一筛选方法，研究小组找到了一个有望增强PD-1检查点抑制剂（癌症免疫疗法的关键成员）有效性的新药物靶点——Ptpn2。

同样，在最新这篇文章中，研究人员也将其候选基因与Cancer Genome Atlas数据库里的36种不同肿瘤类型的突变基因进行了比对，在超过100位患者肿瘤中发现了8个突变基因。

“大多数癌症免疫治疗的研究集中在T细胞和其他（宿主免疫细胞），而不是作为靶标的癌症上，但是大多数靶向治疗，以及致癌信号研究却是集中在癌症细胞内在事件中。这项最新成果是分析癌细胞如何对T细胞和其作用因子做出应答反应的一个范例研究，这一领域的研究也越来越多。”

人体APLNR突变

在这些确定基因中，有一个编码G蛋白偶联apelin受体的基因：APLNR，之前科学家从未发现其与免疫系统功能相关，在几种肿瘤类型样品中发现的APLNR主要是用于调控干γ扰素应答。

研究人员重新分析了两种黑色素瘤小鼠模型中的人体APLNR突变，并进行了过继性T细胞治疗。结果发现与野生型APLNR小鼠相比，免疫治疗的疗效更低。

“APLNR能调控肿瘤细胞中的细胞因子信号，从而有助于提高参与抗体加工和呈递过程的基因的活性，这些抗体也就是T细胞识别的信标，”Restifo解释说。

这项工作强调了干扰素信号传导缺陷对癌症免疫治疗抗性的影响，但是参与干扰素信号传导的基因似乎在癌症中并不常突变。

实际上，研究中确定的554个基因中有541个具有除干扰素信号之外的功能。 Restifo说：“我们仍然不清楚我们研究中发现的大多数基因是否能够帮助T细胞识别肿瘤。”

T细胞激活功能

研究小组还将其鉴定的基因，与此前利用免疫检测点抑制剂治疗患者的204个肿瘤外显子序列的数据库进行了比对，从中发现他们筛选出的基因突变会在对抗CTLA4免疫检查点抗体ipilimumab（品牌名Yervoy）无应答的患者体内富集。而且对免疫治疗做出应答的患者体内并没有出现很多这些基因突变。

这些基因是否能激活T细胞，还有待进一步研究，比如编码参与胚胎发育转录因子的基因：SOX10，会在黑色素瘤中过表达；编码Bardet-Biedl综合征1的蛋白的基因：BBS1也可能在几种器官发育（包括心脏）中扮演重要角色，其它还有编码60S核糖体亚基蛋白成分的RPL23和RPL10。

“通过这项研究，我们对癌细胞如何对T细胞作为反应，以及为何产生抗药性有了更多的了解，”Ribas说。而对于Restifo来说，最终目标是将这些基因用于癌症免疫治疗，并将无应答患者转变为有应答患者。

（生物通：张迪）

原文检索：

S.J. Patel et al., “Identification of essential genes for cancer immunotherapy,” Nature, doi:10.1038/nature23477, 2017.

Mutations Associated with Acquired Resistance to PD-1 Blockade in Melanoma

In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target