全转录组测序文章详解：lncRNA反向遗传学研究的典型案例

　　

研究背景

长链非编码RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）普遍被认为是一类不能编码蛋白的长链RNA。由于其序列较长，所以可以有较大的潜力形成多种复杂构象，从而通过不同生物学途径发挥其作用。此外，由于其不具备蛋白编码能力，因此此类RNA也主要由其碱基序列形成的高级结构来执行生物学功能。著名的lncRNA包括CRISPR基因编辑系统中的guide RNA（脚手架功能，scafford）、神经细胞中特异表达的pnky（蛋白互作）以及X染色体沉默相关的Xist（蛋白互作）等。这些lncRNA通过其各自的形态结构广泛参与了各种生理生化过程。

然而，正是由于lncRNA复杂的高级结构以及编码蛋白的争论，这使得研究人员对lncRNA的探索困难重重。但是，这也并不是说对lncRNA的研究没有任何思路和轨迹可循。科学研究虽然没有捷径，但是找对方向，少走弯路远比无头苍蝇到处飞要高效的多。lncRNA研究虽然在当下颇有难度，但是只要遵循最基本的生命科学研究的遗传学思维，也可以大大降低lncRNA的研究难度。那么，今天大家就随小编一同来看一篇2017年6月刚发表在Nature Cell Biology杂志上的lncRNA反向遗传学案例。在了解lncRNA在肝癌发生中的生物学作用的同时，也来学习一下lncRNA的反向遗传学研究套路。

主要研究结论

1. MBNL3癌胚的剪切因子，促进肿瘤发生导致肝癌预后较差
2. MBNL3敲降可以逆转肝癌发生
3. MBNL3诱导lncRNA-PXN-AS1第四个外显子富集
4. PXN-AS1-L促进PXN基因表达，PXN-AS1-S影响PXN基因稳定性
5. MBNL3、PXN与PXN-AS1-L/PXN-AS1-S一同调控肝癌发生

研究思路

研究结果

1. MNBL3表达量与肝癌预后的关联分析

由于在之前的工作中，研究人员已经通过表达谱芯片的方法鉴定到了一个在小鼠和人类肝癌组织中高表达的基因mnbl3，因此本工作希望能够对肝癌发生的表型从mnbl3的角度进行分子机制的研究。

通常而言，反向遗传学研究在通过某一个性状确定待研究对象（mRNA、lncRNA、circRNA等）之后，便需要对其进行表型观察。在医学领域，表型观察可以包括对特定细胞系的基因编辑和过表达等以及对临床样本进行体内的表型研究等。在此，研究人员采取了传统的反向遗传学研究思路，首先对临床病人的生存率和mbnl3表达量进行了关联分析。结果发现，mbnl3的高表达往往伴随了肝癌病人的高死亡率(图1a-h）。并且该结果在对人类永生未转化的肝脏细胞系（QSG-7701），肝癌细胞系（SMMC-7721，HCCLM3，MHCC97H，Huh7和Hep3B）以及肝母细胞瘤细胞系（HepG2）的研究中均得以确认。

 
图1: mbnl3表达量与肝癌临床病人生存率的关联分析。

2. 转录因子OCT4，SOX2以及NANOG可以增加MBNL3的表达

为了详细阐明MBNL3在肝癌细胞中的表达机制，研究人员聚焦在了3个干细胞转录调控因子OCT4，SOX2以及NANOG上。OCT4，SOX2以及NANOG异常表达可以增加MBNL3的表达量。与MBNL3一致，OCT4，SOX2以及NANOG在肝癌细胞系以及临床样本中同样高表达。生信分析以及ChIP实验确认了这三个转录因子可以结合在MBNL3的启动子上(图1k，i）。这些结果表明，肝癌细胞系以及临床样本中MBNL3的高表达是由OCT4，SOX2以及NANOG这三个转录因子调控的。

3. MBNL3在肝癌细胞与非转化肝脏细胞中的致癌性

为了研究MBNL3在肝癌形成中的作用，研究人员对SMMC-7721和QSG-7701进行了MBNL3的稳定过表达（图2）。通过TUNEL等实验的确认，研究人员认为MBNL3可以驱动肝癌的发生。该结果在临床病人样本中同样获得了证实（图2）。

 
图2: MBNL3驱动肝癌发生

4. MBNL3对肝癌的发生必不可少

为了对MBNL3的表型进行详细研究，研究人员不仅对MBNL3进行了过表达，还同样对其在细胞系中进行了敲降实验，以此来确认MBNL3在肝癌发生中的重要地位。实验结果证明，MBNL3敲降的肝癌细胞系癌细胞的生长显著受到抑制（图3）。该结果连同MBNL3过表达的表型数据不仅确立了MBNL3在肝癌发生中的主导地位，同时还为肝癌诊断与治疗的临床应用提供了潜在的治疗靶标。

图3: MBNL3敲降的表型观察

5. MBNL3诱导lncRNA-PXN-AS1第四个外显子积累

在之前对MBNL3的反向遗传学研究中，研究人员已经成功的对MBNL3的表型进行了深入研究，获得了强有力的证据证实了MBNL3在肝癌发生中的核心地位。然而一个完整的反向遗传学研究光有表型数据还是远远不够的，在此研究人员还对MBNL3调控肝癌发生的具体分子机制进行了深入研究。为达此目的，研究人员首先使用了伯豪生物的全转录组测序服务对稳定敲除MBNL3的SMMC-7721细胞系以及对照进行了转录层面的观察。对RNA-Seq数据结果除了GO和GSEA富集分析外，研究人员还对找到了527个存在显著差异的基因可变剪切。在最显著的可变剪切基因中，研究人员关注到了一个名为lncRNA-PXN-AS1的基因。该基因有5个外显子，其反义链编码PXN基因。对lncRNA-PXN-AS1基因研究发现，其含有2个主要的转录本分别为PXN-AS1-L（包含第四个外显子）以及PXN-AS1-S（不包含第四个外显子）（图4）。MBNL3的过表达会导致第四个外显子显著富集（这暗示了MBNL3可以上调PXN-AS1-L的表达）。紫外交联的免疫沉淀实验确认了MBNL3可以识别4号外显子下游内含子的碱基。

 
图4: MBNL3与lncRNA-PXN-AS1的可变剪切

6. PXN-AS1-L以及PXN-AS1-S对PXN具有相反的调控作用

由于PXN-AS1-L和PXN-AS1-S的反义链可以转录出和肿瘤相关的PXN基因。因此，研究人员怀疑PXN-AS1-L和PXN-AS1-S可能参与了对PXN的调控。研究人员首先通过实验与生信分析确认了PXN-AS1-L和PXN-AS1-S都是不具备编码蛋白能力的lncRNA。其次，对PXN-AS1-L和PXN-AS1-S在SMMC-7721细胞系中的过表达发现，PXN-AS1-L过表达可以导致PXN表达量上升。然而，令人意想不到的是，PXN-AS1-S过表达却导致了PXN表达量下降。通过对这两个lncRNA的深入分析，研究人员发现PXN-AS1-L是通过结合PXN mRNA的3‘ UTR，保护了PXN mRNA不受miR-24-AGO2复合物降解，从而提高了PXN的表达丰度。与PXN-AS1-L完全不一样的是，PXN-AS1-S则通过结合PXN mRNA的CDS区域，抑制了PXN mRNA的翻译延升，从而抑制PXN蛋白在体内的含量（图5）。MBNL3则是通过诱导lncRNA-PXN-AS1的4号外显子表达，间接的增加PXN的表达丰度(图6）。

 
图5: PXN受到不同的lncRNA-PXN-AS1调控

 
图6: MBNL3通过诱导lncRNA-PXN-AS1的4号外显子表达，间接的增加PXN的表达丰度

6. lncRNA-PXN-AS1的4号外显子的生物学功能

为了对lncRNA-PXN-AS1的4号外显子在肝癌发生过程中的生物学作用有进一步的了解，研究人员通过对PXN-AS1-L和PXN-AS1-S分别与肝癌发生进行了表型关联。结果证明，PXN-AS1-L和PXN-AS1-S在肝癌发生过程中具有相反的生物学功能(图7）。

 
图7: PXN-AS1-L和PXN-AS1-S在肝癌发生过程中具有相反的生物学功能

7. MBNL3，lncRNA-PXN-AS1剪切以及PXN在临床组织中的关联分析

如果把一篇完整的逻辑缜密的科研论文比做一篇小说，那么这篇小说不仅仅是内容精彩的小说，还应该是一篇具有完美结局而非虎头蛇尾的小说。用初中作文的写作技巧来描述的话，就叫做前后呼应。本研究工作，起始于对MBNL3的功能研究，牵扯到了lncRNA-PXN-AS1以及PXN等，而最终也必将以MBNL3来终结。因此，在本工作最后，研究人员还从整个信号通路的层面阐述了MBNL3和其互作大分子在肝癌发生中的作用，大大增加了人们对肝癌发生的认识(图8）。

图8：MBNL3，lncRNA-PXN-AS1剪切以及PXN在临床组织中的关联分析

讨论

从肝癌研究人员的角度来看，本工作确实是一篇少有的好文章。其意义在于寻找到了一个在肝癌发生过程中起到主效调控作用的信号通路。为将来肝癌的临床诊断与治疗提供了极大的帮助。从旁观者的角度来看，本工作又确实是一篇及其典型的lncRNA反向遗传学研究案例。从性状到基因定位，再到表型观察继而分子机制研究，完美地诠释了反向遗传学研究的精髓。为我们对lncRNA研究同仁们提供了绝佳的研究思路。综合以上两点，本工作发表在Nature Cell Biology上是实至名归的。

原文出处：
Yuan JH, Liu XN, Wang TT, Pan W, Tao QF, Zhou WP, Wang F, Sun SH. The MBNL3 splicing factor promotes hepatocellular carcinoma by increasing PXN expression through the alternative splicing of lncRNA-PXN-AS1. Nat Cell Biol.2017.