新型ViewRNA原位杂交方法揭示病毒生命周期

　　

经典猪瘟(CSF) 是一种由经典猪瘟病毒(CSFV)引起的具有高度传染性和致命性的传染性疾病。更好的认识理解CSFV的复制周期对研究CSF的发病机理是很重要的。然而，CSFV RNA在感染细胞中的动态分布还不得而知，或当前方法对研究CSFV RNA的动态分布不够理想。例如，电子显微镜和IHC 只能检测到病毒颗粒，且检测灵敏度较低。 实时定量PCR只能检测总RNA，并不适合单个感染细胞中RNA复制的动力学研究。随着新型RNA原位杂交方法的的发展，在培养的细胞或组织切片中定量定位和可视化病毒RNA分子成为非常重要的解决这些关键致病问题的工具。

在这项研究中， 实验者建立了一种新型ViewRNA原位方法揭示CSFV RNA在PK15细胞中的复制周期以及动态分布，为研究CSFV致病机制奠定一个重要理论基础。

此研究结果证明，CSFV RNA进入PK15 细胞早于感染后0.5小时，相对于细胞质隐蔽期(感染后6–9小时)，CSFV RNA曾已经在细胞核中存在过了。这个实验很适合研究CSFV RNA在细胞核中的的生命周期，或是说ViewRNA 原位杂交方法似乎非常适用于检测早期病毒感染阶段CSFV RNA 的动态分布，故其有助于研究CSFV的复制以及有助于设计和开发新的疫苗。

据我们所知，这是首次应用ViewRNA 原位杂交方法揭示毒性CSFV RNA在感染的PK15细胞中的动态分布，并且展现出非常好的特点，比如高灵敏度和高特异性。ViewRNA 原位杂交的灵敏度比荧光抗体试验 (FAT)和免疫组织化学 (IHC)方法高出3到4个数量级（见Fig.1）。特异性实验表明，ViewRNA 原位杂交高度特异性针对CSFV，和阴性对照以及其他猪传染性病毒没有交叉反应（见Fig.2）。

Fig. 1 a CSFV ViewRNA ISH反应灵敏度。靶基因CSFV RNA 显示红色亮点，内参β-actin显示绿色亮点，DAPI染核显示蓝色区域。b CSFV FAT反应灵敏度。c CSFV IHC反应灵敏度。都使用没有被病毒感染的阴性细胞样品作为对照。

Fig. 2 CSFV ViewRNA ISH反应特异性。红色荧光代表CSFV RNA阳性信号，绿色荧光代表β-actin信号；使用没有被病毒感染的阴性细胞样品作为对照；“+”代表结果阳性，“-”代表结果阴性。

开启细胞内定位RNA分子的新时代----单拷贝级别灵敏度的ViewRNA原位杂交技术！

RNA 原位杂交除了是对传统蛋白水平上的IHC和DNA 水平上的DNA FISH的补充，而且又有其独特的优势： mRNA、lncRNA、miRNA、cirRNA、HBV cccDNA、各种病毒、特殊物种、神经细胞等等都能检测。不像病毒、特殊物种的IHC受抗体的限制，特别是病毒，一般比较复杂，分为很多亚型，变异性强，往往一种新的病毒出现时，还没有对应的抗体研发出来。且时下热门的lncRNA、miRNA、cirRNA由于不表达蛋白，故RNA水平的检测无疑是绝佳的选择。

传统的原位杂交技术局限于灵敏度、特异性不高，而大部分RNA拷贝数在细胞中都很少，而且像一些癌症病人来源的组织穿刺样本，样本本身量就特别少，所以高灵敏度的原位杂交技术就显得尤其重要。So，基于b-DNA信号放大技术的单细胞单拷贝级别灵敏度的ViewRNA原位杂交技术无疑开启了细胞内定位RNA分子的新时代！其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。

除了上述这些优点，ViewRNA的多重靶标共标定位、RNA与蛋白共定位是不是更酷更有吸引力！ViewRNA原位图必将助力发高分高质量文章！

该方法的具体优势列举如下：

1.应用广泛：针对任意RNA靶标的简单杂交分析，无放射性，无需抗体；
2.高特异性：基于**的探针组设计和branched DNA (bDNA)信号放大技术；
3.极高灵敏度：单细胞水平实现单拷贝级别灵敏度；
4.兼容降解的RNA样本；
5.无需RNase-free操作和环境要求，一天即可完成实验；
6.多重靶标共标定位；
7.实现RNA与蛋白共定位；
8.检测结果稳定一致性，兼容高通量自动化平台。

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