达康书记说了，想要提高GDP，3D细胞赶紧上

在这明媚的春光里，小编怀着激动的心情为大家献上全新的3D细胞培养检测大餐，此前我们也推出了不少针对3D细胞培养的案例，而这次的方案不仅有图，有数据，后面还能亲身体验真相哦^_^

　　

现在提到3D细胞培养，想必大家都不陌生，这项技术在新药研发过程中可以帮助科学家少走弯路，在组织工程学领域也有巨大的应用前景。 《Nature》：脑部前额3D类神经器官体外组装成功

但是小编听说很多朋友都觉得3D细胞培养“不接地气儿”，“难养”，“养出来不知道怎么用”等等，针对这些问题，BioTek联合Corning公司建立了一套系统的解决方案，献给准备3D的你~

好啦，进入正题，今天要介绍的方案是“基于3D共培养体系的肿瘤侵袭研究”。小编将此方案剖析为三步：

1如何构建混合培养的3D细胞侵袭模型？

    我们想要开展3D细胞培养，选对武器比什么都重要，在这个方案中，我们选择了Corning公司的3D细胞培养板，这种细胞培养板具有超低吸附表面的U形底部，非常适合肿瘤细胞或干细胞等生长形成为3D结构，是一种无骨架介质外源添加构建3D细胞培养的绝佳培养体系，如下图。

Corning Spheriod Microplates 96/384体系
优势：1，96/384体系符合标准ANSI/SBS规格。2，黑色孔壁能够使得荧光检测表现更出色。3，U形底+低亲和力Ultra-Low表面材质有助细胞形成规格统一的3D立体结构。4，透明底部可供自动化成像仪清晰成像

    非常非常关键的一点是，使用Corning的3D细胞培养板，构建3D细胞培养的过程无需特殊的处理，同常规的细胞培养法相同，也就是说您的细胞该怎么养，还是怎么养，需要注意的是初始接种细胞数量的不同，最终成球的尺寸也不同，如果保证初始铺板细胞数量相同，那么这种3D细胞培养板能更好地形成规格均一的3D细胞球。因此该体系也非常适合配合自动化液体处理设备，比如之前我们提到的MultiFloFX。

上图：Cytation5对96孔板内不同初始细胞数量在培养时间段内形成的3D细胞球形态成像。下图：使用Gen5图像分析软件定量测定不同铺板细胞条件，肿瘤球的投影面积变化。

    Cytation5&LionheartFX的活细胞检测模块使用时间序列视频合成法忠实地记录下来了细胞在U形底板中形成肿瘤球的过程。同时可以用图像分析的方法对3D细胞球的形成进行质控（上图）。

    在我们这个案例中，构建了乳腺癌细胞和Fibroblast细胞的共培养体系，并且在细胞成球后，添加含有趋化因子及抑制剂的基质胶替换液体培养基，用于肿瘤细胞和成纤维细胞的侵袭模型。

3D肿瘤细胞侵袭模式示意图，其中MDA-MB-231表达GFP荧光蛋白，Fibroblasts表达RFP荧光蛋白。

2如何定量分析3D细胞培养体系的侵袭？？

    混合培养的肿瘤细胞3D模型的侵袭实验周期比较长，设定每天使用Cytation5或LionheartFX对整个肿瘤球进行Z-stack叠加成像，用于观察和定量分析肿瘤球的迁移情况。

添加10 ng/mL CXCL12趋化因子后，MDA-MB-231/Fibroblasts 3D细胞共培养体系在不同时间内，的侵袭情况。图像是明场，GFP和RFP通道的三色叠加。

    对于Gen5软件而言，可以通过图像强度阈值、图像目标尺寸阈值等参数识别出肿瘤细胞球的覆盖面积，并通过自动添加Mask的功能，对每组样本进行定量统计。

Gen5图像分析软件对肿瘤细胞球的参数进行分析

Gen5软件对GFP表达的MDA-MB-231细胞的侵袭面积做自动Mask识别，并且给出不同时间点的侵袭面积统计分析，并采用面积绝对值和相对比值进行统计。

Gen5软件对明场条件的共培养体系的MDA-MB-231细胞的侵袭总面积做自动Mask识别。

Gen5软件特定识别不同时间点的侵袭出3D细胞球结构外的细胞数量

    所以，我们千辛万苦得到的3D细胞培养体系，Cytation5不仅能得到吸收光测定的MTT、CCK8；发光法测定的ATP-Glo等结果，还能够全自动为每个3D细胞样本进行全方位图像捕获，并通过Gen5软件用不同的图像分析方法评价细胞迁移、侵袭等结果。

3如何在3D细胞水平探讨MOA？？

    肿瘤的侵袭和转移是一个多细胞、多阶段的过程，其中细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)的降解是关键的步骤之一。MMP-3可降解BM中的IV型胶原，也可促进其它类型的MMPs包括MMP1（间质胶原酶）的合成，而后者主要作用底物为纤维性胶原，可降解ECM中的胶原纤维和明胶及改变细胞的微环境。MMP1还可以改变细胞的微环境，作用于肿瘤发生的初始阶段，从而有利于肿瘤的形成。因此MMP蛋白酶可作为潜在的药物作用靶点，而评价MMP蛋白酶的活性是MOA机制探讨的评价标准之一。
传统的明胶酶谱或WB的方法，无法在完整的细胞水平实现MMP的检测，更不用说活细胞水平的测定了。而构建3D细胞体系的目的之一便是在立体的结构内观察细胞内信号通路或特定蛋白表达的分布、强度等变化，因此更需要活细胞检测手段。Enzium公司开发的新型MMP基质金属蛋白酶家族的检测探针EnSens®则非常适合在活细胞水平对各类MMP蛋白酶进行测定。

Ensens MMP蛋白酶测定原理。该方法无需抗体，并且采用近红外荧光探针，检测背景低，灵敏度高，并且酶作用的底物肽可定制。

3D肿瘤侵袭模型测定MMP蛋白酶模型示意图，在构建形成3D细胞球后，加入含有趋化因子、抑制剂及MMP酶底物肽和荧光染料探针。

    Cytation5及LionheartFX可配置专用的近红外荧光探针成像通道，包括CY5、CY7等，在这个模型中，可通过高倍物镜对3D细胞球的侵袭范围进行成像，可直观的观测MMP蛋白酶在肿瘤球内部及外部树突状伪足内的分布。并采用Gen5软件的图像分析功能定量统计荧光强度，从而判断MMP酶的表达变化。

未加入MMP酶抑制剂的样品组，在3D细胞培养时间段内，红色荧光表达逐渐增加，提示MMP酶表达增加。

高倍镜下，可清晰观察到MMP酶在肿瘤球的标志性侵袭结构“Invadopodia”中的表达。

 加入不同浓度的MMP蛋白酶抑制剂GM6001后，MMP酶的分布变化，及不同的MMP蛋白酶家族（MMP14，MMP2，其余结果未展示）底物探针检测结果。

    今天小编介绍的这个3D的方案也是为了起到抛砖引玉的作用，如果您觉得图文还不过瘾，BioTek公司将和康宁生命科学于5月22日下午在上海联合举办一场针对3D细胞培养的专场研讨会索取BioTek公司&康宁生命科学“上海3D细胞培养的专场研讨会”相关资料，欢迎各位童鞋光临。