药物发现中的代谢轮廓分析

了解代谢组学研究的影响因素与降低生物化学和化

　　

目的
为代谢组学生物标记物的发现开发一套全新的自动化工作流程和仪器分析方法。

前言
在制药行业中，代谢组学用于研究潜在候选药物的药理学响应所产生的生化变化，其识别毒性 / 药效标记物的能力可以显著加速药物研发的进程并帮助制定合适的临床计划。来自于液相色谱 - 质谱联用技术（LC-MS）的代谢轮廓实验数据，包含大量的化学噪音，常常干扰生物标记物的发现。本文采用全新的质谱技术和数据处理软件来降低动物实验中的化学背景，进而研究药物诱导的变化与动物年龄和营养的关系。

常规 LC-MS 代谢组学研究存在很多冗余的（一种组分有多个离子）和不相关的（化学噪音）数据。同时影响代谢轮廓的外部因素（年龄、营养）增加了生物多变性。由于许多化学物质是未知的，因此，在进行结构鉴定前过滤掉假阳性结果尤为重要。超高分辨率仪器结合超高效液相色谱（UHPLC）的分离可以提供足够的分辨率将代谢物与化学背景区分开，解决了化学噪音和数据冗余的问题。准确质量数能确保识别相关信号所需要的精细数据处理。此技术可大大减少数据量，并改进目标代谢物的定量。生物因素对代谢轮廓有着深远的影响，即使细小的代谢变化也会掩盖药物诱导的代谢效应。了解大鼠的正常代谢变化能使“生物噪音”降到最低，并提供更为可靠的药物相关的代谢变化信息。

实验部分

样品前处理
抽取各组雄性大鼠（饱食，急慢性禁食，不同年龄）的血液样品并进行 LC-MS 分析。取 50 µL 血清样品，加入 100µL 含 0.1% 甲酸的冷甲醇溶液以除去蛋白质。干燥样品，加入200 µL10% 甲醇水溶液复溶。每份样品中加入N- 苯甲酰基-D5-甘氨酸（tR = 4.27 min， m/z 185.0969）作为内标。

液相色谱
采用 Thermo ScientificTM Open AccelaTM 1250 UHPLC 系统和 Thermo ScientificTM Hypersil GOLDTM aQ 色 谱 柱（150 × 2.1mm, 1.9 µm粒径）进行色谱分离。进样量为3 µL。色谱条件如下：

 

质谱
采用 Thermo ScientificTMQ ExactiveTM Focus Hybrid QuadrupoleOrbitrap 质谱仪（图 1）分别在正离子和负离子模式下采集得到高分辨率准确质量数（HRAM）数据，分辨率为 70,000（FWHM）。

数据处理
采 用 Thermo ScientificTM SIEVETM 软 件 的 组 分 提 取（Component Extraction, CE）数据处理算法分析数据，测定大鼠禁食产生的代谢效应。

结果与讨论
图 2 显示了 N- 苯甲酰基 -D5- 甘氨酸内标物的高质量LC-MS 数据。在质量轴校准后的 25 到 35 小时之间采集血清QC 重复样的正离子模式数据，展示了 UHPLC 分析时间内优异的峰面积和质量数测定的稳定性。基线处的色谱峰宽为 3.6 s，每个峰获得了 15 次扫描。图 3 显示了测定内源代谢物的元素组成时分辨率为70,000 的重要性。 A+2 同位素（m/z 313）附近的展开图中显示存在一个 34S，这在 35,000 分辨率下（模拟）是不可能发现的，因为分辨率较低时， 13C2 同位素与 34S 是不能分辨的。

 

 

组分提取软件的数据处理工作流程如图 4 所示。该软件能像分析人员一样解析数据，批量处理各个数据文件，而不是单独处理，并将每次运行得到的信息用于验证下一次运行获得的信息。按照这种方式，由于每种组分在数据集中的最大浓度点定义，从而大大减小了数据缺失值现象。同样的组分在低浓度样品中时，可以采用更靶标性的方法实现鉴定和定量。实验得到高度简化的数据。数据处理去除了系统产生的大量噪音，得到了更严格的统计学分组和更可靠的差异分析和组分推断结果。

表 1 中的大鼠研究实验用于监测禁食对大鼠代谢过程的影响。图 5 显示了喂养大鼠控制样组、混合 QC 样和禁食 4、 12和 16 小时血清样主成分分析（PCA）的高质量聚类分析结果。结果清晰地显示了喂养和禁食大鼠血清代谢组的区别，以及不同禁食时间的代谢组差异。图 6 显示了随禁食时间变化增加（Met 甲硫氨酸， 20:4 FA 二十碳四烯酸）和减少（Pro 脯氨酸，18:2 LPC 溶血磷脂酰胆碱）的代谢物。如图 6 所示，混合血清 QC 重复样中的每种代谢物均呈现极佳的重现性。因此，没有必要做技术性重复样。图 7 说明在实际 LC-MS 分析中，尽管正离子和负离子模式的运行时间相隔 30 小时，血清中尿酸的测定结果在两种模式下仍然一致。研究证实，该 LC-MS 平台和方法非常耐用。从而推断生物多变性是这些数据中噪音的主要来源。

结论
Q Exactive Focus 质谱仪为非靶标代谢组学研究提供了一种精密和耐用的平台。此平台拥有与 UHPLC 兼容的超快扫描速度，能在外标法校准后的相当长时间内，在正离子和负离子两种模式下均保持优异的质量数准确度和响应值稳定性。不需要做技术性重复样。高达 70,000 FWHM 的分辨能力能测定精细同位素轮廓，有助于清晰地推断元素组成。若要消除研究中大量的噪音干扰，可以采用 SIEVE 软件中的智能化数据简化工具来实现化学噪音的显著降低。此外，系统化的研究有助于生物噪音的表征，同时代谢组学预筛选功能帮助鉴定出生物离群值，从而确保整个研究的一致性。如本研究所示，禁食是模型设计中的一个显著变量，禁食数据有助于分析很多由药物引起的代谢物变化。研究发现，大鼠禁食对代谢轮廓分析有着深远的影响。虽然大多数代谢变化在一定程度上是比较细微的，但是禁食能突显或掩盖掉一些药物引起的代谢影响。