lncRNA FISH原理、方法与实例：Stellaris RNA FISH[新品推荐]

RNA的荧光原位杂交（FISH）长期以来一直是用于检测和定位RNA的不可或缺的工具，是其他基因表达分析方法重要的补充。觉得很复杂？只需不到一天就可以完成！

Biosearch提供了一种简洁的RNA FISH方案，可用于在固定哺乳动物细胞中同时成像多种原始和成熟mRNA、lncRNA、和RNA变体。该技术利用荧光预标记的短DNA寡核苷酸（长度约20个核苷酸），合并组成探针组（一组可多达48个独立探针）。多个寡核苷酸与相同一RNA靶标的整体结合，不需要酶反应的信号扩增，即可产生强荧光信号，显示RNA或单RNA分子簇为点状斑点。阳性信号是由多个探针的组合定位荧光来确定的。单个探针的脱靶结合仅产生弱的和扩散的荧光，远低于用于检测特异性靶向的阈值；集体脱靶可能性很小，这使得假阳性和假阴性的可能性都降至最低。这种设计使得Stellaris RNA FISH探针可以结合到部分降解的靶mRNA，使得它们非常适合福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样品。通过使用宽场荧光显微术，这些点状信号的可视化使得能够将单个转录物的计数灵敏度精确至每个细胞一个拷贝。此外，通过使用具有不同光谱荧光基团的探针组，可以实现对基因特异性RNA或RNA变体的多重分析。

RNA FISH对于长非编码RNA（lncRNA）尤其重要。lncRNA由于缺乏蛋白质产物和通常存在多个剪接变体，作用机制不明确，对其研究颇具挑战性。RNA FISH不单可以定位lncRNA，还增加了区分原始和成熟lncRNA转录物的能力，并由此得以将作用位点与合成位点分开，可在转录事件和成熟lncRNA的位置和耐久性之间添加时间空间信息，是lncRNA分析的有用工具。

Biosearch用于检测选定lncRNA靶标的探针组，包含MALAT1，NEAT1 5'区段，NEAT1中间区段和XIST。以这些探针组定位的lncRNA能够清楚的区分对位核斑体（paraspeckles）中的NEAT1，核斑体（speckles）与MALAT1。

  

Stellaris RNA FISH（荧光原位杂交）是一种RNA可视化方法，可使用宽视场或共聚焦荧光显微镜同时检测，在亚细胞水平上对固定样品中的单个RNA分子进行定位和定量。一组Stellaris RNA FISH探针包含具有荧光标记的多个不同序列的寡核苷酸，可沿相同靶标共同结合到目标转录本上，产生点样荧光信号。

Stellaris RNA FISH技术遵循一个简单的方案，无需使用外来试剂，价格经济，和平台无关。当天即可提供结果，样品类型和应用类型都可以多种多样。 Stellaris RNA FISH探针甚至可以用几种不同的染料标记，以实现不同RNA靶标的同时多重检测。综上，科学家可以以此追踪基因表达的随机性质，不用分离纯化和扩增，通过直接检测来观察RNA。

灵敏度和特异性

Stellaris RNA FISH分析中的大多数探针确保兼具高灵敏度和高特异性。这种直接检测方法的固有冗余度能保证假阴性和假阳性信号的可能性最小化。阳性信号是由多个探针的组合定位荧光来确定的。单个探针的脱靶结合仅产生弱的和扩散的荧光，远低于用于检测特异性靶向的mRNA的阈值。更重要的是，Stellaris RNA FISH探针可以结合部分降解的靶mRNA，使得它们非常适合福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）组织样品。

多重靶标
Stellaris RNA FISH探针有多种荧光基团可供选择，包括Biosearch Technologies的CALFluor和Quasar染料，可用于多重靶标测定。多重测定中的染料选择在很大程度上由研究者可用的滤光片确定。可以设计包括DAPI核染+三种光谱重叠最少的荧光报告基团标记的Stellaris RNA FISH探针组。

多重测定可用于鉴定多个基因之间的表达水平的相关性，同时运行一个已知表达目标的对照探针组。Biosearch提供了适用于人类细胞作阳性对照的目录探针集。这些基础基因探针集用Quasar 570染料标记。

Stellaris RNA FISH还可以与现有技术如qPCR，DNA FISH，IHC（免疫组织化学）和western印迹结合以提供补充信息。

Stellaris RNA FISH方法 由四个步骤组成，不需要特殊的试剂，整个过程可以在不到一天内完成。

步骤1：准备样品
样品在＃1盖玻片上生长或粘附或切片，并用70％乙醇透化。在不同样品类型的样品制备会有轻微变化。都不需要蛋白酶。

步骤2：杂交探针
对于大多数样品，杂交可以在通常的实验室培养箱中在+ 37℃下在4小时内完成。

步骤3：洗涤样品
杂交后，洗涤缓冲液短暂孵育以除去过量的探针。此步骤的总时间为1 - 1.5小时。

步骤4：样本成像
样品可以使用标准荧光显微镜成像。建议使用宽场荧光显微镜。共焦显微镜也可以使用Stellaris RNA FISH探针。

lncRNA研究案例：

来自麻省理工学院Tyler Jacks实验室的Dimitrova等人在Molecular Cell发表的一篇论文，使用Stellaris RNA FISH技术回答了关于“促细胞凋亡的lncRNA（lncRNA-p21）是否可以通过顺式或反式作用机制调节来附近基因”的问题。lncRNA-p21和p21的表达是响应p53信号通路的活化刺激。这一通路涉及到肿瘤的抑制、并且是响应DNA损伤和细胞应激引起的，一直是一个重要的研究领域。

研究人员想要研究lncRNA-p21作用于影响p53介导的转录反应的机制。长片段非编码RNA能顺式调节位于其转录位点附近的基因的表达，有时其作用范围会扩展更远一些——作用于同一染色体上更远距离的基因。相比之下，反式作用的lncRNA作用于独立位点，抑制或激活基因表达。

作者使用Stellaris RNA FISH进行定位研究，并得出结论：lncRNA-p21以顺式作用调节p21表达。首先，作者用TAMRA标记的Stellaris RNA FISH探针显示证明了lncRNA-p21定位于细胞核。然后，在缺乏lncRNA-p21的细胞中进行阴性对照实验，其中超过90％的lncRNA-p21 -/- 细胞不含有lncRNA-p21荧光星状RNA FISH信号。

接下来，作者通过针对lncRNA-p21内含子、标记有Quasar 670染料的Stellaris FISH探针，进行单基因iceFISH（TM）分析，以鉴定其表达位置的基因组位点。iceFISH使用Stellaris探针靶向RNA内含子。由于内含子在剪接后迅速降解，因此可以测量积极转录的基因。由于内含子探针标记采用不同于外显子探针组的荧光团，因此作者能够观察到外显子和内含子lncRNA-p21信号之间的紧密共定位（参见下图，这是如何工作的示例图）。结果表明，这种特异的lncRNA可以通过顺式机制作用于p21基因。利用Stellaris RNA FISH还另外收集了顺式作用机制的进一步证据：在lncrRNA-p21 -/- MEFs中，lncRNA-21的过表达不能挽回p21水平，并导致过表达的RNA在细胞质的不当定位和输出。

iceFISH：使用Stellaris探针靶向RNA内含子。因为内含子在剪接后快速降解，这就使得测量活跃转录的基因成为可能。