坏死性凋亡：在合适的时间点使用合适的检测[创新技巧]

在对坏死性凋亡（necroptosis）有了一定的了解之后，相信大家已经迫不及待要开始检测了。其实，对坏死性凋亡的检测而言，关键的挑战在于将它与凋亡和坏死区分开。细胞很容易从凋亡转到坏死性凋亡，反之亦然，而继发性的坏死也往往发生在凋亡的后期阶段。因此，细胞死亡的检测要辅以实时的形态分析以及死亡通路的抑制或敲除。同时，找对采样的时间点，这也很关键。

质膜完整性受损

大家都知道，；利用非通透性的DNA结合染料（如DAPI、PI或7-AAD）能鉴定细胞死亡时的质膜完整性受损。当质膜破裂时，这些染料进入细胞并与DNA相结合，产生强烈的荧光。传统的流式细胞仪和成像流式细胞仪能够提供细胞大小和形态的信息，帮助区分活的、坏死和凋亡的细胞。在坏死性凋亡的早期阶段，细胞肿胀导致前向和侧向散射增加，但随着质膜破裂和细胞内容物的渗漏而迅速减少。

通过annexin V和PI的双染色可将细胞分为健康（annexin V和PI阴性）、早期凋亡（annexin V阳性，PI阴性）以及晚期凋亡/继发性的坏死和坏死性凋亡（annexin V和PI阳性）。分析形态上的差异，可进一步区分这些细胞（下图）。坏死性凋亡的细胞显示出弥散的PI染色和强烈的荧光信号，而经历晚期凋亡/坏死的细胞则出现收缩。

坏死性凋亡细胞出现在右上象限，数据来自Bio-Rad的ZE5流式细胞仪。

用PI染色细胞核也可以区分坏死性凋亡细胞和坏死细胞。经历坏死性凋亡的细胞维持染色质结构和明显的核仁染色，相比之下，凋亡继而坏死的细胞因染色质结构崩塌和核小体间裂解而表现出均匀的染色。这下，是不是开始心里有底了。

不过，细胞制备也特别注意。如果使用的是贴壁细胞系，则在流式分析之前需要将其从培养皿或培养瓶中解离。如果可能的话，让细胞悬浮生长，以避免解离过程引起的细胞损伤。如果实现不了，那么可通过PI/Hoechst染色，用高内涵显微镜来分析贴壁细胞。

细胞内含物检测

细胞内含物的存在也可以说明组织和器官中的细胞死亡，比如乳酸脱氢酶（LDH）或线粒体DNA，但仅凭这些组分并不能说明细胞通过哪种途径死亡。高迁移率族蛋白（HMGB1）、IL-1α、IL-33和亲环素A的释放可能表明坏死性凋亡发生，但这种现象也存在于巨噬细胞活化或全面凋亡中。因此，我们还是有必要通过延时视频显微镜或透射电子显微镜来实时评估细胞形态，证实细胞的死因是坏死性凋亡。

线粒体膜电位

罗丹明123、四甲基罗丹明甲酯（TMRM）、四甲基罗丹明乙酯（TMRE）以及JC-1等荧光探针都可以在具有完整膜电位（即非凋亡或非坏死）的线粒体中发出明亮的荧光。而在坏死性凋亡的早期阶段，线粒体膜电位的超级化导致荧光瞬时增加。质膜破裂使膜电位消失，导致相应的荧光下降。这些数据可通过流式细胞仪、荧光显微镜或荧光读板机测得。

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形态上的变化

在经历死亡这个过程时，细胞的形态是不断变化的。因此，随着时间的变化不断测定，才能确认坏死性凋亡。延时视频显微镜能够将单个细胞的形态变化与分子、亚细胞和生化事件相关联，从而区分坏死性凋亡和凋亡。PI等非通透性的DNA结合染料，可以确定质膜通透性，并区分坏死和坏死性凋亡。不过，大家最好优化一下实验，以避免光毒性，最大限度减少实验诱导的细胞死亡。通常，减少暴露时间，降低光源电压和相机上的像素合并都能减少细胞损伤的风险。

透射电子显微镜尽管耗时又昂贵，但通常被认为是评估形态的金标准，因为它能够以高分辨率产生细胞形态的图像。不过，制备过程可能会损害细胞形态，为此需要采用其他的方法来维持细胞完整性。Vanden Berghe等人曾在2013年提出一种方法，利用附着在组织培养板底部的巨噬细胞来捕获濒死的细胞。

抑制和敲除

广谱的caspase抑制剂，如zVAD-fmk或Q-VD-Oph，往往被用来阻断caspase激活，或证实坏死性凋亡的发生。尽管这些抑制剂能够阻断大部分的外部信号，但可能无法完全阻断内部途径，其中caspase的作用是在线粒体膜电位发生不可逆损失之后加速细胞死亡。

此外，人们也采用RIPK1抑制剂（necrostatin-1）和MLKL抑制剂（necrosulfonamide）来阻断坏死性凋亡。不过，necrostatin-1可能在某些细胞中诱导细胞凋亡，并且在区分坏死性凋亡和凋亡上不够特异。因此，需要额外的敲除策略来补充抑制实验的数据。敲除RIPK3或MLKL可以阻断坏死性凋亡，但也可能使细胞转移到另外一条死亡途径。因此，在敲除发生后分析细胞死亡的类型是很重要的。

关键蛋白质检测

当然，我们也可以利用western blot、免疫组化或流式细胞仪来检测坏死性凋亡途径中的关键蛋白质，比如RIPK3、RIPK1和MLKL，来支持形态学实验结果。磷酸化MLKL（Ser358和Thr357）是最精确的蛋白，可确认坏死性凋亡是通过RIPK3介导的MLKL激活。此外，RIPK1/ procaspase-8的高比例也说明了环境有利于坏死性凋亡。

结语

尽管坏死性凋亡是目前研究最透彻的程序性坏死，但其他受调控的细胞死亡也被确定，包括细胞焦亡（pyroptosis）、铁死亡（ferroptosis）、parthanatos、亲环蛋白D依赖的坏死等。这些通路并非孤立的，因此在未来研究程序性细胞死亡的通路时，有必要考虑通路之间的串扰和互作。如此看来，对于细胞是如何死亡的，即使是福尔摩斯也要动一番脑筋啊。（生物通 余亮）

参考文献：

Assessing Cell Health: Necroptosis