赛默飞质谱助您辨别“挂羊头，卖狗肉”

　　

引言
“挂羊头，卖狗肉”是日常用的一个熟语。虽然随着时间的发展，这句话已经难以反应最真实的情况，在世界上大部分地方，狗已经不作为食用肉的来源，即使在极少数食狗肉的地方，狗肉的价格也往往比羊肉还高，已经失去了造假的意义。但是，这种商品标识与实际商品的组成不一致的情况，却是长期存在的。 自从 2013 年欧盟“马肉风波”之后，中国肉类掺假的现象也屡见报道，进一步加深了人们对肉类真实性的担忧。这种非标明的添加，极大的扰乱的市场次序，影响相关宗教人士、特殊风俗与部分肉类禁食人士的情感与健康，也带来了潜在致病性和疾病控制的难题。目前最常用检测的方法有：基于核酸的聚合酶链式反应技术（PCR），和基于抗体抗原结合的酶联免疫法（ELISA）。前者受到 DNA 降解，复杂基质的干扰和样品提取与扩增方法的影响，干扰了定性和定量的准确性。后者往往受制于抗体的制备，加工过程中蛋白变性，复杂基质和近亲缘种属之间同源干扰导致的假阳性的影响 [1, 2]。

随着生物质谱技术的成熟，大规模的定性和定量研究蛋白表达谱的技术已经很成熟。因此，利用质谱技术寻找不同肉类样品特征性蛋白或者多肽，并进行定量，能够避免现在最常用的PCR 技术和 ELISA 所面临的上面的种种问题，其优点包括：不受食品加工的过程影响，因为氨基酸序列比核酸序列在加工过程中更容易保存；同时实现定性与定量，避免假阳性且定量结果更加准确可靠；能够同时监测多种添假 [2]。猪肉，禽肉，牛肉和羊肉是世界上消耗量最大的四种肉类 [3]。大多数情况下，羊肉最贵，可能比最便宜的禽肉贵到 5倍以上，在实际生活中，对不法商人具有最大的掺假诱惑力。我们基于超高分辨的 Q Exactive 质谱平台，研究了五种常见肉类彼此之间的特征性专属多肽。选取其中找到的部分多肽，通过人为的将几种不同的肉类进行混合研究，模拟现实中掺假的情况，用TSQ Qµantiva 建立了基于 SRM（Selected Reaction Monitoring）的掺假比例定量方法。整个实验流程如下（图 1）：

实验方法：
1.材料与样品制备
本实验所用肉类样品牛肉，猪肉，鸡肉和鸭肉购自于上海某大型超市，羊肉购自于上海某羊肉专卖店。五种肉类样品分别去皮与脂肪取纯肌肉样品约 100 mg，用 RIPA 裂解液裂解后丙酮沉淀，尿素溶解后取部分测浓度，剩余样品还原烷化，酶切过夜，固相萃取除盐，离心浓缩后用 0.1%FA 溶解后备用。

2.掺假实验
将鸡与鸭的裂解液等比例混合，取羊 1 µg 总蛋白酶切产物六份，分别添加鸡和鸭的裂解酶切产物 1 µg、 100 ng、 10 ng、 5 ng、1 ng、 0.1 ng，模拟不同比例的掺假样品，每份样品进样三次。

3.色谱条件
液相 RSLC U3000 ，流速 0.2 mL/min，流动相 A 相为 0.1%FA/H2O，流动相 B 相为 0.1% FA/ACN。色谱柱 Accucore-150-C18， 100mm*2.1mm。梯度条件为：

4.质谱采集方法
质谱离子源参数设置为：喷雾电压 3500 V，鞘气 38 Arb，辅气15 Arb，反吹气为 0 Arb，离子传输管温度 275℃，离子源雾化温度为 380℃。质谱采集参数为：采集周期为 0.3 s， 碰撞气为 1.5mTorr， Q1 和 Q3 分辨率都为 0.7，源内裂解能量为 0。

实验结果
1.种属特征性多肽的确认

种属特征性多肽寻找验证是肉类掺假实验的关键点，因此我们通过高分辨的 Q Exactive 质谱平台，研究了常见的五种肉类。选出每个物种专属性的多肽，去掉含有酶漏切位点的多肽，鉴定到各个物种相对于其他四种物种专属性的多肽条数为：鸡339 条，鸭 125 条，猪 426 条，牛 337 条，羊 152 条。其中，鸡和鸭都为鸟纲家禽类，羊、牛、猪为哺乳纲真兽亚纲动物，前两者之间的进化亲缘关系更近，我们同时找到了鸡和鸭相对其他三种兽类专属性的多肽 336 条。 Pep003 为来源于鸡/鸭的特征性肽段，图 2 为利用 TSQ Quantiva 在不同掺假比例的样本中定量 Pep003 的 XIC（eXtracted Ion Chromatogram）图：

2.定量离子对的选择
依据丰度信息，我们选取了六条鸡与鸭的特征性多肽（不含漏切位点，不含甲硫氨酸，不含 NXS/T 的糖基化基序），导入 Pinpoint 软件，利用 Pinpoint 软件自动导出离子对与碰撞能量信息，先采集一遍样品的信息，利用 Pinpoint 软件生成schedule 信息，导入仪器自动生成最后的采集方法。方法中的离子对信息见下表：

3.定量结果与定量下限
通过将鸡肉与鸭肉按不同比例掺加到 1 µg 的羊肉中，利用 SRM的方法，定量研究能够检测到的最低掺比比例，并利用 Xcalibur定量模块对上面的多肽分别进行定量，确定线性范围。其中Pep001 和 Pep003 都能够定量到 5 ng 的最低掺假，剩下的四条能够定量到 10 ng 掺假。即分别能够检测到 0.5% 比例的掺假和 1% 比例掺假，实际标准曲线与线性范围如下：

4.利用 QED 进行定性确证
QED（Qualitative Enhanced Data）扫描功能是指通过监测 SRM实时采集信号，利用二级子离子强度触发，采集对应母离子二级碎裂全扫描谱图，在定量的同时，获得更确切的定性信息的功能。通过 QED 技术，我们采集了 Pep003 的 QED 质谱图，图 4 为理论多肽 Pep003 实际谱图与理论 b、 y 离子匹配结果：

讨论
1.监测的专属性多肽的数目
在发现性研究中，文献中报导的 6 条猪专属性多肽 [4-6]，我们只找到了其中的一条，还有两条是单氨基酸突变，另外三条没有找到；文献中报导的 21 条鸡专属性多肽我们找到了 17 条 [6, 7]，其中有一条文献报道有乙酰化修饰，而我们检索过程没有加这个修饰。现代家猪由野猪驯化而来，经过了约 9000 年的长期的驯化与饲养过程中，亚种间和亚种内核型都发生了很大的差异，不同的地域或者品系的猪在蛋白表达上都有极大的差异 [8]；而单氨基酸多态性（Single amino acid polymorphism， SAP）是自然界普遍存在的现象，地域和个体差异都能造成这种结果。基于上面的这些信息，由于动物基因型的差别，以及样品处理过程带来的影响，每一个物种仅选择一条多肽进行定量，很有可能造成大面积的假阴性的检出结果，有必要提高每个物种监测的多肽的数目，降低假阴性的概率。

2.可以利用一些亲缘关系相近的物种之间共有的多肽，实现同时筛选的目的

鸡与鸭作为常见的肉食性禽类，相对其他三种肉类来说，亲缘关系要更近一些，而且我们确实发现，它们共有的特异性多肽的条数（336条）甚至大于我们找到的鸭特异性多肽的条数（125条）。通过这种方式，还能够部分的弥补很多物种蛋白数据库不完善的情况（鸭的蛋白数据库就不全）。同时，鸡鸭同时共有而又相对兽类特异的多肽，往往也增加了其他禽类共有的可能性，一定程度上更经济的部分实现一些未知禽类物种添加的可能性。

结论
我们基于赛默飞全方位的质谱解决方案，建立了从掺假的发现，到定量多肽的选择，以及定量的实现的完整流程，并对发现的部分多肽进行了掺假实验与定量能力考察。基于实验结果，对于每一个物种，我们应该同时监测尽可能多的多肽，尽量避免假阴性的结果。我们同时选取鸡和鸭的六条特征性多肽，同时对两种禽类肉掺假进行了监测，并确定了最低的掺假监测限为 0.5%。考虑到掺假比例的经济性与可操作性，远远超过了实际监测的需求。与传统的基于 PCR 和抗体的检测方法相比，质谱具有大致相当的灵敏度，但是拥有更好的避免假阴性与假阳性的结果的能力，且能够避免由于加工所带来的 PCR 或者抗体相关的空间结构破坏所带来的影响。

与上述掺假相比，还有一种相对来说，更为严重，性质更恶劣的掺假——病死肉的掺假。基于上述的思路，我们认为，通过进一步系统的研究，质谱也能够成为一种监测病死肉的手段，斩断病死肉流入餐桌的魔爪，与我们全方位的农残筛查与检测手段一起，为食品安全提供全方位的保障。同时，利用这种研究方法，我们还能助力有机肉类产品生产商，提供从肉类良种选择依据到肉类质量标准建立的可能性。

参考文献：
1.Nakyinsige, K., Y.B. Man, and A.Q. Sazili, Halal authenticity issues in meat and meat products. Meat Sci,
2012. 91(3): p. 207-14.
2.Sentandreu, M.A. and E. Sentandreu, Peptide biomarkers as a way to determine meat authenticity. Meat
Sci, 2011. 89(3): p. 280-5.
3.http://www.fao.org/ag/againfo/themes/en/meat/background.html.
4.von Bargen, C., et al., New sensitive high-performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry method for the detection of horse and pork in halal beef. J Agric Food Chem, 2013. 61(49):
p. 11986-94.
5.von Bargen, C., J. Brockmeyer, and H.U. Humpf, Meat authentication: a new HPLC-MS/MS based
method for the fast and sensitive detection of horse and pork in highly processed food. J Agric Food
Chem,2014. 62(39): p. 9428-35.
6.Montowska, M., et al., Rapid detection of peptide markers for authentication purposes in raw and
cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal Chem,
2014. 86(20): p. 10257-65.
7.Sentandreu, M.A., et al., A proteomic-based approach for detection of chicken in meat mixes.
J Proteome Res, 2010. 9(7): p. 3374-83.
8.Ramos-Onsins, S.E., et al., Mining the pig genome to investigate the domestication process. Heredity
(Edinb), 2014. 113(6): p. 471-84.