PNAS：更有效的新反向遗传学系统

　　

生物通报道：轮状病毒是引发严重腹泻的最常见原因之一，每年都会夺去数十万婴儿的性命，虽然目前的疫苗能有效预防轮状病毒的恶化，但是科学家们希望能研发出更多低成本的，更有效的疫苗。

然而目前的技术手段无法分析轮状病毒如何在细胞中侵入和复制的，为了鉴别在轮状病毒的感染过程中哪些基因至关重要，来自大阪大学微生物疾病研究所的科学家报道了一种新型基于质粒的反向遗传学系统。

这一研究成果公布在《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上，领导这项研究的副教授Takeshi Kobayashi说，“反向遗传学能帮助我们获得人工改造的病毒。使用反向遗传学，我们可以令一个基因发生突变，然后观察这对病毒的影响”。

目前反向遗传学已经被用于了许多种病毒研究中，用以分析病毒繁殖的条件，但是要针对像是轮状病毒这样的多片段RNA病毒细胞并不容易，这一研究组通过两个病毒蛋白：FAST和VV capping enzyme解决了这个问题，他们将这两种蛋白加入到质粒系统中，利用其优势，突变了轮状病毒的单个蛋白：NSP1，结果表明这可以减少病毒的复制，从而检验了这一系统。

未来通过进一步在所有蛋白中进行全面检测，研究人员希望能找到令轮状病毒成为严重公共威胁的关键决定因子，“我们希望可以修改轮状病毒的繁殖和致病性，”Kobayashi说。

Kobayashi对于这一质粒反向遗传学系统充满信心，“因为没有人可以人工合成轮状病毒，因此我们对这种病毒的复制和发病机制了解甚少”。他希望这一新系统将促进轮状病毒的研究工作，并指导研发更有效的疫苗。

此前，来自云南大学的一组研究人员利用小RNA深度测序和反向遗传学分析发现，在暴露铜绿假单胞菌PA14的秀丽隐杆线虫中，mir-233是UPR激活所必需的。铜绿假单胞菌感染能够以p38 MAPK依赖性的方式，上调mir-233的表达。定量蛋白质组学分析将SCA-1——sarco/内质网Ca2+-ATPase的线虫同系物，确定为mir-233的靶点。在铜绿假单胞菌PA14感染期间，mir-233可抑制SCA-1的蛋白水平，这反过来又导致UPR的激活。而mir-233突变体对于铜绿假单胞菌感染更加敏感，敲除sca-1可导致对铜绿假单胞菌造成的杀伤产生更强的抵抗力。这项研究表明，micro-mRNA依赖性通路通过激活UPR，对先天免疫产生一定的影响。

原文摘要：

Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses

Rotaviruses (RVs) are highly important pathogens that cause severe diarrhea among infants and young children worldwide. The understanding of the molecular mechanisms underlying RV replication and pathogenesis has been hampered by the lack of an entirely plasmid-based reverse genetics system. In this study, we describe the recovery of recombinant RVs entirely from cloned cDNAs. The strategy requires coexpression of a small transmembrane protein that accelerates cell-to-cell fusion and vaccinia virus capping enzyme. We used this system to obtain insights into the process by which RV nonstructural protein NSP1 subverts host innate immune responses. By insertion into the NSP1 gene segment, we recovered recombinant viruses that encode split-green fluorescent protein–tagged NSP1 and NanoLuc luciferase. This technology will provide opportunities for studying RV biology and foster development of RV vaccines and therapeutics.