用RNA-seq快速绘制大脑图

　　

生物通报道：在过去的十年中，DNA和RNA测序技术已迅猛发展并且更加便宜，现在它们被运用到各种新的领域中。最近在《Neuron》发表的一项新研究中，研究人员使用RNA测序技术，在单个神经元水平上绘制小鼠的大脑图。这种新技术被称为Multiplexed Analysis of Projections by Sequencing (MAPseq)，可能比目前的方案更快和更容易。延伸阅读：华人学者构建新的大脑图谱；《科学》：迄今为止最详细的大脑连接图 。

这项研究的第一作者、冷泉港实验室Anthony Zador教授的研究生Justus Kebschull说：“有了MAPseq，我们试图查明单个神经元最终到达哪里。”Zador的团队积极开发MAPseq，因为缺乏高通量方法来跟踪单个神经元。

在这项新的研究中，研究人员向一个选定的脑区，注射了一种含有大量RNA分子的失活病毒。每个RNA分子都有其独特的“条码”序列，每一个都在一个神经元中结束，并通过轴突。几天之后，研究人员解剖大脑，收集和测定来自不同脑区的RNA条形码。

通过将来自注射脑区与其他脑区的RNA条码进行匹配，研究人员可以追踪单个神经元最终到达哪里。Kebschull说：“这是利用测序和条形码用于高通量神经解剖学的第一个例子。”

快速地映射连接
弄清神经元是如何连接的，是理解大脑如何运作的一个重要组成部分。Kebschull说：“如果你认为大脑就像一台计算机，我们就需要知道什么与什么连接在了一起，比如硬盘是否连接到了处理器。”

在目前的许多脑成像技术中，研究人员都是在神经元中表达一种荧光标记，并用显微镜观察哪些大脑区域发光。但是Kebschull说：“每一个脑区有数千个神经元。”这些“批量跟踪”方法不能区分单个神经元，因此，研究人员无法区分两个源神经元最终到了同一区域，还是不同的区域。这是重要的信息。“不同的神经元可能具有不同的属性，并可能携带不同的信息。”

其他的脑成像技术可以跟踪单个神经元，但这些方法都是劳动密集型的和费时的。Kebschull说：“跟踪一个单一的神经元需要数周的时间。如果你想研究成千上万个神经元，你基本上完蛋了。”相反，MAPseq用了一个星期的时间，就绘制出了一个注射脑区的几千个神经元图，速度发生了一千倍的提升。

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适应现有的工具
Zador和他团队的灵感来自以前的脑成像技术，如Brainbow，研究人员随机表达荧光标记物来标记不同的神经元，具有各种各样多种的颜色（2）。但使用显微镜能够容易区分的颜色数量有限，出于实际的目的，研究人员在这些模型中一次可以至多跟踪10个神经元。

Kebschull说：“有了MapSeq，我们考虑从颜色切换到随机核酸序列。”利用核酸条码序列，将提供更多样化的标志物，使用目前的高通量测序方法，这些可能是非常快速和相对便宜的读数。从30个核酸序列的一段序列开始，研究人员将最终获得1018个可能的序列，是小鼠大脑中神经元数量的10个数量级以上。

在2012年，Zador首次建议使用条码测序用于高通量的大脑映射，那么，研究人员必须弄清技术细节（3）。他们决定使用一种无效的Sindbis病毒——在神经科学中常用的一种工具，来将条码RNA序列运送到小鼠的神经元中。但他们马上遇见了一种并发症。

Kebschull说：“人们认为是非复制型的病毒，其实是复制型的。”因此，病毒粒子传播超越了初级感染的神经元，来标记其他神经元，这将使得映射分析变得复杂化。对于新技术，Kebschull制备了一种重组Sindbis病毒，能感染神经元，但不传播，为进一步改进铺平了道路（4）。

一旦RNA条码进入神经元，研究人员必须确保它们沿轴突运输到它们的终端。为此，他们添加了一种工程化的蛋白质，并表明它能有效地工作。此外，研究人员希望确保每个标记的神经元收到一个独特的条码，并且他们计算了必须注入多少病毒，才能实现这一目标。Kebschull和Zador也弄清了如何用高通量测序准确地识别条形码（5）。

测试技术
Zador的团队在小鼠大脑蓝斑（LC）的一部分中测试了MAPseq，这个脑区是一种激素去甲肾上腺素的来源。去甲肾上腺素可调节警觉性和专注力，来自LC的神经元是否延伸整个皮质或只到达特定区域，尚不明确。Kebschull说：“LC是一个很好的测试案例。”

使用MAPseq，研究人员发现从LC神经元投射出许多各种各样的图案，一些神经元到达一个特定的靶标，其他神经元则伸展的更广泛。因此，来自LC的去甲肾上腺素可以到达整个皮质，以及在特定区域有更严重的影响，这与以前的研究结果一致。

目前的研究只使用一种病毒注射到LC，Zador和他的团队正在努力增加寻找其他病毒。最终，他们希望利用MAPseq同时跟踪整个皮层的神经元。Kebschull说：“我们正在扩大这种方法，以开展更多的高通量神经解剖学。”研究人员还计划在不同疾病的小鼠模型中使用MAPseq。“我们可以研究不同的自闭症或发育疾病小鼠模型，以探析大脑的连接是如何错误的。”

（生物通：王英）

生物通推荐原文：
1. Kebschull JM, Garcia da Silva P, Reid AP, Peikon ID, Albeanu DF, Zador AM. High-Throughput Mapping of Single-Neuron Projections by Sequencing of Barcoded RNA. Neuron. 2016 Aug 17. pii: S0896-6273(16)30421-4. doi: 10.1016/j.neuron.2016.07.036. [Epub ahead of print]

2. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Lu J, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62.

3. Zador AM, Dubnau J, Oyibo HK, Zhan H, Cao G, Peikon ID. Sequencing the connectome. PLoS Biol. 2012;10(10):e1001411. doi: 10.1371/journal.pbio.1001411. Epub 2012 Oct 23.

4. Kebschull JM, Garcia da Silva P, Zador AM. A New Defective Helper RNA to Produce Recombinant Sindbis Virus that Infects Neurons but does not Propagate. Front Neuroanat. 2016 May 24;10:56. doi: 10.3389/fnana.2016.00056. eCollection 2016.

5. Removing distortions from high-throughput sequencing data: Kebschull JM, Zador AM. Sources of PCR-induced distortions in high-throughput sequencing data sets. Nucleic Acids Res. 2015 Dec 2;43(21):e143. doi: 10.1093/nar/gkv717. Epub 2015 Jul 17.