Science发布创新性CRISPR/Cas9技术

　　

生物通报道  利用一种脱氨酶将单核苷酸改变导入DNA中，研究人员创建了一种改进的CRISPR/Cas9工具，它能够避免生成有害的双链断裂，减少采用CRISPR/Cas9技术可能引入的附加突变，且不需要添加DNA模板。这项发布在8月4日《科学》（Science）杂志上的新研究工作，是第二次报道这样的精确基因编辑工具。

哈佛大学的George Church说：“这些脱氨酶解决了先前一些基因组编辑工具，包括TALENSs、ZFNs和Cas9最大的问题：期望的基因编辑会与非同源末端连接(NHEJ)介导的随机插入和缺失发生竞争。这一系统还减少了双链断裂引起的毒性。”Church实验室也已开发出一种基于脱氨酶的编辑工具。

哈佛大学化学生物学教授David Liu的实验室近期采用了一种不同的脱氨酶证实了一项相似的技术。Liu说：“当另一个实验室复制出一项重要的研究发现时，对于该领域常常是极大的鼓舞及有帮助的。在这里作者们还证明了这一基因编辑策略在细胞中起作用。”

采用CRISPR/Cas9系统，研究人员可通过将Cas9导入细胞中，造成双链断裂，随后细胞利用一个DNA模板来修复这一断裂，由此编辑DNA序列。这一编辑过程依赖于细胞的同源重组机器，但其他的修复机制，包括NHEJ会竞争执行修复，导致不必要和不精确的插入与缺失。

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共同研究作者、神户大学的Akihiko Kondo说：“在双链断裂修复过程中，许多事情同时发生，有时候核苷酸以一种脱离我们控制的方式被删除、插入或突变。”

为了构建出更精确的编辑工具，Kondo和他的同事们将一种无法切割双链DNA的无核酸酶活性的Cas9版本，或可生成一个缺口（单链断裂）的一种切口酶Cas9，与来自七鳃鳗的激活诱导胞苷脱氨酶(AID)融合在一起。AID酶通常会在免疫球蛋白和抗体基因中生成突变，造成免疫系统多样性。AID对单链DNA起作用，将胞嘧啶(C)替换为尿嘧啶(U)，在下一轮的DNA复制过程中U再转变为胸腺嘧啶(T)。

测试这种新的杂合复合物在缺乏内源性AID样系统的芽殖酵母中改变一个选择性标记的能力，研究小组发现当借助于向导RNA这一蛋白质复合物靶向CAN1基因时，相比于非靶向选择标记，CAN1突变的频率提高了1000倍。利用全基因组测序，研究人员证实几乎没有脱靶突变，只背景突变率略有增加。研究作者、Kondo实验室博士后Keiji Nishida说：“在存在AID的情况下这一突变率是可以接受的，比自然背景突变率高不到10倍。”

研究人员还证实了与Cas9-脱氨酶复合物一起表达两种不同的gRNAs，同时改变两种基因的能力。

采用缺口酶Cas9的复合物比采用核酸酶失活Cas9的复合物效率略高。由于核苷酸切除修复可以修补AID造成的核苷酸置换，“如果在互补链造成一个缺口，不再有参考序列来纠正这一置换突变，可使得期望的核苷酸置换过程更有效，”Nishida说。

做出进一步的改进，研究人员在Cas9-脱氨酶复合物上连接了另一种酶：一种尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂，提高了这一复合物生成C-T置换的效率，将在哺乳动物细胞系中生成的偶然缺失突变减到最小。

这一基因编辑复合物也在哺乳动物细胞系中很好地起作用，生成了相对较少的脱靶突变。在酵母中，相比表达标准CRISPR/Cas9系统的细胞，表达任一版本的DNA编辑复合物都可导致更好的生长，表明新工具也具有较小的毒性。

这一所谓的靶向AID复合物具有高特异性，可改变靶基因中3-5个碱基对窗口内的C。Nishida 说：“我们惊讶于这一突变窗口如此的狭窄。”与之相比，在近期发布的一项研究中Liu和同事们报道的采用来自于大鼠的一种脱氨酶的基因编辑工具变体，窗口范围为3-6个核苷酸(三篇Nature文章：CRISPR研究重大进展 )。“为了最大限度地使用它，碱基编辑窗口要求不能太宽也不能太窄，因此两种方法为研究人员提供了更多的选择是非常有帮助的，提高他们可以解决自身碱基编辑需求的机会，”Liu说。

对于Church来说，开发这一工具用于临床的一个关键问题是要进一步检测突变脱靶效应。另一个问题是如何在不击中靶序列中邻近胞嘧啶的情况下，靶向特异的单个胞嘧啶。

根据Kondo所说，他的研究小组想进一步扩展这项研究工作，连接Cas9和其他的酶构建出一种全方位的DNA编辑工具箱，可以生成任意的4种核苷酸替换组合。

2016年4月，来自麻省大学医学院的科学家开发出了一项利用CRISPR/Cas9的新技术：CRISPRainbow，它使得研究人员能够在活细胞中标记和追踪7个不同的基因组位点。这一标记系统将成为实时研究基因组结构的一个宝贵的工具，研究人员在Nature Biotechnology发布了关于它的详细资料（马涵慧博士Nature Biotechnology：突破性CRISPR新技术 ）。

基因编辑工具CRISPR-Cas9现在可作为一种灵活、易使用的方法，靶向及追踪活细胞中RNA的活动。加州大学圣地亚哥分校的研究人员在2016年3月17日Cell杂志上发布了一种新方法，通过从几个方面改造CRISPR-Cas9系统，其有可能最终可用于研究广泛的疾病相关RNA过程，及操控基因转录进行疾病建模（Cell重要突破：首次利用CRISPR技术追踪RNA ）。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文索引：

K. Nishida et al., “Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems,” Science, doi: 10.1126/science.aaf8729, 2016.