湖北农科院用CRISPR制备基因敲除克隆猪

　　

生物通报道：来自湖北省农科院畜牧兽医研究所、河南科技大学和中科院水生生物研究所的研究人员，用CRISPR/Cas9系统和Cre/LoxP，敲除了猪初生细胞中肌生成抑制蛋白（MSTN）的一个等位基因，制备了无选择标记的MSTN基因敲除克隆猪。相关研究结果发表在8月17日的《Scientific Reports》杂志。湖北省农科院畜牧兽医研究所的郑新民研究员和河南科技大学动物科学学院的董发明教授，是本文共同通讯作者。

可预测的、无污染的转基因家畜，对于可靠的表型和生物安全，都是很重要的。因为不想要的序列的引入，如SMGs（选择标记基因），已经引起了公众对于食品安全、生物多样性和农业生态系统的强烈担忧。SMGs经常用于细胞介导的转基因，使我们能够分离出转基因细胞。但是一旦操作完成，它们在从这些细胞制备而来的GM家畜中，就没有任何价值，相反，残留在家畜中的SMGs还可能成为一种负担。

有几种方法可以用来制备无SMG的转基因家畜。然而，到目前为止，这些方法固有的技术局限性，阻碍了无污染转基因方法的常规使用。例如，将一个表达组件直接显微注射到受精卵中，可避免任何SMG的使用，但是效率非常低、随机整合并存在潜在的嵌合现象，从而导致这种方法是不切实际和昂贵的。相反，传递mRNA或编码蛋白质的可编程核酸酶（如CRISPR/Cas9），已被证明是制备无SMG转基因家畜的一种有效策略。

Cre/LoxP重组系统被广泛用于转基因小鼠，用以组织特异性的基因打靶以及基因切除。然而，Cre/LoxP在转基因家畜中仍未得以很好的研究，只有少数研究描述了它在大型动物中的效用。

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在这项研究中，研究人员通过CRISPR/Cas9和Cre/LoxP制备了无SMG的功能性MSTN（肌生成抑制蛋白）基因敲除克隆猪。他们利用CRISPR/Cas9介导的同源重组（HR），来敲除猪初生细胞中MSTN的一个等位基因。然后，用Cre重组酶来切除SMG，有效率为82.7%。研究人员通过流式细胞仪分离出了无SMG的非EGFP细胞，并被立即用作供体细胞核用以核移植。分子测试在这项克隆猪中验证了单等位基因MSTN KO和SMG删除。免疫印迹显示，在MSTN中大约有50%的降低，同时肌原性基因在肌肉中的表达有所增加。组织学检查显示，肌纤维数量增加，但是肌纤维大小保持不变。超声波检测显示，最长肌大小增加，背脂肪厚度降低。猪MSTN基因的精密编辑，产生了无SMG的MSTN KO克隆猪，提供了一种可靠的途径用于家畜良种生产，也提出了一种策略来减少潜在的生物学风险。

另外在今年6月，Nature子刊《Scientific Reports》在线刊登了同济大学、中科院上海生命科学研究院、上海交通大学以及加州大学洛杉矶分校的一项研究成果。在这项研究中，研究人员用CRISPR技术制备了一组Lep突变大鼠，它们在成熟LEP蛋白中携带14th Ile (LEP∆I14)无效突变或者缺失。相关阅读：同济教授用CRISPR制备瘦素缺陷大鼠。

肌生成抑制蛋白（Mstn）是哺乳动物骨骼肌质量的一个保守的负调节因子。然而，在家畜中是否能够实现Mstn的精确敲除，能否被安全地用来提高产肉性能，尚未得到证实。近期，来自南京农业大学、斯坦福大学等处的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“Generation and evaluation of Myostatin knock-out rabbits and goats using CRISPR/Cas9 system”的研究成果，该研究利用CRISPR/Cas9来制备Mstn基因敲除家兔和山羊，然后分析了它们的表型变化，对上述问题进行了探讨。相关阅读：南京农大用CRISPR制备基因敲除兔和山羊。

到目前为止，密切模拟人类病理和行为缺陷的神经系统疾病猴模型，还没有被成功地制备出来。8月9日，国际学术期刊《Cell Research》在线刊登了我国科学家的一项重要研究成果，这项研究采用TALEN技术，制备了小头畸形致病基因MCPH1突变体食蟹猴模型，并对这种MCPH猴模型的表型进行了描述。相关阅读：我科学家用TALEN技术制备神经疾病猴模型。

（生物通：王英）

注：郑新民，男，1960年生，湖北省农业科学院，研究员。先后主持湖北省自然科学基金“转基因猪外源基因拷贝数遗传规律的研究”、湖北省攻关项目“转基因猪表达人血清白蛋白的研究”、“奶牛胚胎快速低成本性别鉴定”等课题。做为骨干参加九五“863”项目“瘦肉猪基因工程育种”和“异种器官移植转基因动物模型研究”、十五“863”项目“转基因猪用于临床器官移植的研究”，国家自然科学基金课题“猪胚胎细胞核移植的研究”，湖北省攻关课题“猪胚胎移植技术的研究”、“猪卵巢卵母细胞体外成熟及体外授精的研究”、“猪ICM注入囊胚获得嵌合体的研究”等。

董发明，1992年中国人民解放军农牧大学硕士毕业。本人已从事中兽医学、猪病防治等教学研究20余年，多次获得校、院优秀教师称号，两此被评为校招生就业先进个人。曾先后主持完成河南省科技攻关项目“河南省规模化养猪场主要疫病调查及防制技术规范研究和推广”，“专业化猪场主要传染病监控技术研究与推广”，“高产鸡产蛋下降原因调查及防治模式研究”。参加国家自然科学基金项目“兔脑炎原虫病的分子及免疫病理学研究”等的研究工作。

生物通推荐原文摘要：
Isozygous and selectable marker-free MSTN knockout cloned pigs generated by the combined use of CRISPR/Cas9 and Cre/LoxP
Abstract: Predictable, clean genetic modification (GM) in livestock is important for reliable phenotyping and biosafety. Here we reported the generation of isozygous, functional myostatin (MSTN) knockout cloned pigs free of selectable marker gene (SMG) by CRISPR/Cas9 and Cre/LoxP. CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination (HR) was exploited to knock out (KO) one allele of MSTN in pig primary cells. Cre recombinase was then used to excise the SMG with an efficiency of 82.7%. The SMG-free non-EGFP cells were isolated by flow cytometery and immediately used as donor nuclei for nuclear transfer. A total of 685 reconstructed embryos were transferred into three surrogates with one delivering two male live piglets. Molecular testing verified the mono-allelic MSTN KO and SMG deletion in these cloned pigs. Western blots showed approximately 50% decrease in MSTN and concurrent increased expression of myogenic genes in muscle. Histological examination revealed the enhanced myofiber quantity but myofiber size remained unaltered. Ultrasonic detection showed the increased longissimus muscle size and decreased backfat thickness. Precision editing of pig MSTN gene has generated isozygous, SMG-free MSTN KO cloned founders, which guaranteed a reliable route for elite livestock production and a strategy to minimize potential biological risks.