简单小窍门，将CRISPR-Cas9基因编辑效率提高5倍

　　

生物通报道  CRISPR-Cas9是用于人类细胞系中敲除基因以发现基因功能的一项首选技术，但其让基因丧失功能的效率却有着巨大的差异。

加州大学伯克利分校的研究人员现在找到了一种方法，可在大多数类型的人类细胞中将CRISPR-Cas9切割及让基因丧失功能的效率提高5倍，使得构建及研究基因敲除细胞系变得更容易，并有潜力让突变基因丧失功能作为一种人类疗法。

科学家们在不断地发现新基因或它们编码的蛋白，但要阐明它们在体内或疾病中的作用则难得多。发现这一作用的关键在于要让基因丧失功能，看看当除去它时会发生什么。

尽管CRISPR-Cas9可以加速生成基因敲除细胞系的过程，研究人员有时必须制造并筛查这一遗传剪刀的许多变体来找到能够很好地起作用的CRISPR-Cas9。加州大学伯克利分校的研究人员发现进行简单的调整，可以将这一过程的效率提高许多倍。

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关键是将不与人类基因组中任何DNA序列匹配的一些DNA短片段，与CRISPR-Cas9蛋白一起导入到细胞中。这些称作为寡核苷酸的DNA短片段似乎干扰了细胞中的DNA修复机制，将普通CRISPR-Cas9s的编辑性能提高了2.5-5倍。

首席研究员、加州大学创新基因组计划科学主任、分子与细胞生物学副教授Jacob Corn说：“事实证明，如果你做件非常简单的事——只是供给细胞在人类基因组中任何地方没有同源性的、廉价的合成寡核苷酸，编辑率将提高5倍。”这一技术可以提高所有CRISPR-Cas9s的效率，甚至是那些最初根本无法发挥作用的CRISPR-Cas9。

获得更高的效率，研究人员将能够更成功地构建出他们想要的基因敲除细胞系，随后利用它们来探索一个基因或一组基因的功能。因为大多数长寿细胞系都来源于癌细胞，包括非常受欢迎的HeLa细胞系，这些细胞系的每个基因通常具有超过正常两个以上的拷贝。这使得难于同时敲除所有的拷贝，更高的效率大大提高了成功的机会。

当要敲除基因纠正人体内的遗传突变时高效率也很重要。医生们一直在考虑敲除使得人们容易罹患感染性疾病，如艾滋病，或自身免疫、炎症或神经退行性疾病的一些基因。Corn和同事们描述的这种方法是否能够用于治疗仍有待观察，但它对于实现研究目的非常有效。

这些结果在线发布在8月17日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。

DNA修复是CRISPR-Cas9成功的关键

CRISPR-Cas9分子是由一个蛋白质剪刀Cas9蛋白，和告诉Cas9结合与切割DNA位置的地址所构成。这一技术依赖于，当你切割DNA时细胞的修复机制并不总是能正确重建DNA链，而是在让基因丧失功能，破坏其活性的序列中生成了一个错误。

地址是由20个核酸分子构成，与靶基因DNA序列互补的向导RNA。这一向导RNA像一条尼龙搭扣那样结合DNA，导致了Cas9切割双链DNA。

自加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和于默奥大学的Emmanuelle Charpentier在2012年发明这一技术以来，一些向导RNAs能够很好地起作用，导致Cas9近100%切割基因并让其丧失功能，而另一些结合但却很少或根本不敲除基因的原因一直是个谜。Corn说，切割效率随细胞类型和特定细胞系而异。

Corn怀疑，Cas9偶然不良的切割效率可能与DNA的修复方式有关，因为细胞间DNA的修复机制有差异。他推断，与人类DNA非同源的任意DNA链或许可以扰乱修复过程，提高基因敲除成功率。

“它给了细胞轻轻一击，阻止了正常的修复。”

Corn将CRISPR-Cas9基因编辑描绘为是切割与DNA修复之间的一场竞争：在Cas9切割DNA后，细胞会精确地替换切割DNA，Cas9再度切割DNA，在无休止的切割和修复循环中直至修复酶生成一个错误，基因最终功能失常。或许，寡核苷酸降低了修复过程的保真度，或让细胞切换至更易出错的一种修复，使得Cas9能够更为容易地打断基因。

Corn说，下一个前沿是利用DNA修复的一些特性，提高序列插入，用正常的基因来替换缺陷基因，并有可能治愈一种遗传性疾病。

CRISPR/Cas系统可以构建出多个基因精确突变的小鼠，但其效率低下阻碍了生成足够数量的转基因小鼠来建立人类疾病模型。通过添加一种抗癌药物Scr7到遗传编辑的受精卵中，Whitehead研究所的科学家将CRISPR/Cas的效率显著提高了19倍。这一重要的成果发表在2015年3月的Nature Biotechnology杂志上（Nature技术突破：将CRISPR效率提高19倍）。

通过将CRISPR/Cas9系统注入到受精卵中，可一步构建出携带单基因或多基因突变或获得其他遗传改造的小鼠。尽管这一技术是有效的，但它需要进行显微注射——只能一次对一个受精卵实施这一有着一定技术难度且耗时的操作。在发表于2015年6月《Genetics》杂志上的一篇研究论文中，研究人员证实电穿孔是一种可替代显微注射的更快、更高通量的策略（王皓毅博士：提高CRISPR/Cas9效率和通量的新策略 ）。

来自中国医学科学院、上海科技大学的研究人员报告称，在大鼠中他们通过抑制非同源末端连接（NHEJ）以及利用Cas9蛋白提高了CRISPR/Cas9介导的精确基因组编辑的效率。这一研究成果发布在2016年5月10日的RNA Biology杂志上（中国学者：提高CRISPR/Cas9介导基因组编辑的效率 ）。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文索引：

Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications, 2016; 7: 12463 DOI: 10.1038/ncomms12463