南开大学:“自杀式”CRISPR/Cas9系统

　　

生物通报道：8月9日，来自南开大学和北京师范大学的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“A ‘suicide’ CRISPR-Cas9 system to promote gene deletion and restoration by electroporation in Cryptococcus neoformans”的研究论文。这项研究提出了一种“自杀式” CRISPR-Cas9系统，使我们能够通过后续的互补作用，验证基因的功能，并有可能减少脱靶效应。因此，这项技术适用于新型隐球菌的功能基因组学研究。这项研究的通讯作者是南开大学生命科学学院的朱旭东教授。点击阅读南开大学的最新研究成果：南开大学：基于PacBio平台的全长转录组测序；南开大学：基于PacBio平台的全长转录组测序；南开大学Cell子刊发布表观遗传新文章。

作为原核生物的一种适应性免疫机制，集群定期间隔短回文重复（CRISPR）和CRISPR相关（CRISPER-Cas）系统，使宿主能够防御噬菌体和其他可移动的元素和载体。CRISPR-Cas9系统在基因组编辑中的效力广受好评，特别是难以进行遗传操纵的生物体。为了构建这一系统，需要两个基本组成部分：一个单一的嵌合引导性RNA（gRNA）成分，是通过将约20nt的靶序列RNA（crRNA）与一段订制的细菌tracrRNA、以及细菌Cas9内切酶的一个蛋白质成分融合而产生的。

这一系统通常被转化到宿主细胞以进行功能表达。用以gRNA和Cas9核酸酶生产的表达组件将在很大程度上持续存在于宿主中——甚至在编辑过程完成后，作为异位整合副本或自由复制的DNA分子（minichromosomes）。因此，这种方法有其固有的缺陷，如Cas9内切酶的潜在毒性和伴随细胞增殖而积累的靶基因突变。触发不良遗传学变化的CRISPR-Cas9系统通常出现脱靶效用，在某些生物中CRISPR-Cas9是有细胞毒性的，包括酿酒酵母和裂殖酵母。

科学家在研究中遇到的另一个实际问题是，CRISPR-Cas9系统在细胞中的持久性，会阻止新生隐球菌（C. neoformans）中突变基因的修复，因为该系统也靶定包含相同gRNA靶序列的互补基因。这种局限性代表了一个重要的问题，在编辑系统的实际应用中必须解决，因为CRISPR-Cas9表达组件的体内存在，并不适于许多的应用（例如，生物医学和农业）。即使是在微生物的实验室研究中，剩余的CRISPR-Cas9 DNA也会降低该系统作为基因组操纵工具的有利度。

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担子菌酵母新型隐球菌（C. neoformans）作为艾滋病相关真菌病和其他基本生物问题的一种模型，已经得以广泛的研究，并存在低的同源重组频率，特别是D型菌株。目前已经开发出来两种不同的转化系统——基因枪转化和电穿孔转化，通过同源重组破坏许多基因。然而，这些方法实现的同源重组频率，在A型和D型菌株之间有着显著的差异。基因枪转化是一种昂贵的程序，可以通过同源重组实现A型菌株的基因破坏，频率在2%和50%之间，而D型菌株系列的频率在1%和4%之间。

此外，在D型菌株中，电穿孔转化可引起1/1000到1/100,000的同源重组频率。其他基因组编辑技术，例如锌指核酸酶或TAL效应物核酸酶（TALENS），在这种菌一直没有相关报道。因此，构建一个功能性CRISPR-Cas9系统来进行靶向基因删除和基因重组，用于酵母的毒性研究，有着重要的意义。

在这项研究中，研究人员报道了一种自发消除CRISPR-Cas9系统的方法，而不会影响其强大的编辑功能。该研究小组在一种内源性U6启动子和人密码子优化的Cas9内切酶的驱动下，成功地表达了单个引导RNA。该系统可在酵母中有效地生成一个插入缺失突变，并通过电穿孔法，经由同源同源性修复，有效地进行靶向基因中断。

然后，该研究小组通过CRISPR-Cas9表达组件到重组构建的顺式排列，证明了该系统的自发消除。在系统介导的双交换之后，CRISPR-Cas9组件被裂解和降解，这可通过Southern blotting得以验证。这种“自杀式” CRISPR-Cas9系统，使我们能够通过后续的互补作用，来验证基因的功能，并有可能减少脱靶效应。因此，这项技术有潜力用于新型隐球菌的功能基因组学研究。

（生物通：王英）

注：朱旭东，教授、博士生导师。1986年毕业于南开大学生物系，获学士学位；1989年毕业于中国科学院微生物研究所，获硕士学位；1989-1994年在中国科学院微生物所工作，任助理研究员、人事处处长；1994年8月赴美国康奈尔大学（Cornell University）留学，1999年1月获博士学位；1999-2002年，在美国西北大学（Northwestern University）医学院从事博士后研究工作；2002 -04年，在Illinois州立大学医学中心工作。2005年回国。现任中国微生物学名词名称审定委员会委员，国家留学基金委员会评审专家，中国微生物学会分析专业委员会委员、真菌专业委员会委员，《微生物学报》、《生物工程学报》编委。主持国家自然基金、“863”、“973”等项目。在国内外学术期刊发表论文近60篇，参编专著2部，获得授权专利3项。

生物通推荐原文摘要：
A ‘suicide’ CRISPR-Cas9 system to promote gene deletion and restoration by electroporation in Cryptococcus neoformans
Abstract：Loss-of-function mutagenesis is an important tool used to characterize gene functions, and the CRISPR-Cas9 system is a powerful method for performing targeted mutagenesis in organisms that present low recombination frequencies, such as the serotype D strains of Cryptococcus neoformans. However, when the CRISPR-Cas9 system persists in the host cells, off-target effects and Cas9 cytotoxicity may occur, which might block subsequent genetic manipulation. Here, we report a method of spontaneously eliminating the CRISPR-Cas9 system without impairing its robust editing function. We successfully expressed single guide RNA under the driver of an endogenous U6 promoter and the human codon-optimized Cas9 endonuclease with an ACT1 promoter. This system can effectively generate an indel mutation and efficiently perform targeted gene disruption via homology-directed repair by electroporation in yeast. We then demonstrated the spontaneous elimination of the system via a cis arrangement of the CRISPR-Cas9 expression cassettes to the recombination construct. After a system-mediated double crossover, the CRISPR-Cas9 cassettes were cleaved and degraded, which was validated by Southern blotting. This ‘suicide’ CRISPR-Cas9 system enables the validation of gene functions by subsequent complementation and has the potential to minimize off-target effects. Thus, this technique has the potential for use in functional genomics studies of C. neoformans.