无血清细胞转染真的安全吗 | Variantpro用户文章

　　

前言

第二军医大学顾明君教授带领的科研团队首次将联川的VariantPro™靶向测序文库制备技术运用到临床疾病的研究当中。研究结果充分显示出VariantPro™靶向测序文库制备技术高覆盖度、高均一性、高准确性的性能。这也暗示了VariantPro™这项新技术可进一步运用于人类疾病研究。

研究背景

线粒体是细胞内产生能量的细胞器，因此，线粒体呼吸链功能失调会影响几乎所有的机体组织。人类线粒体DNA（mtDNA）为环状双链DNA分子，长16,569bp，包含37个基因。据报道，mtDNA突变是很常见的，已经成为人类疾病包括糖尿病、心血管疾病、癌症、神经肌肉疾病，以及衰老的重要原因，发病率约为1/4300。缺血是各种类型的细胞都会面临的强大压力，但目前，缺血是否会引起mtDNA突变，从而导致血管疾病仍不清楚。

VariantPro™是一套创新的基于多重PCR的靶向测序文库制备技术，实现了一步法完成靶向序列捕获和文库制备的全过程。这套系统采用了全新的Relay-PCR™和Omega Primer™技术，可以制备出超高均一性和特异性的扩增子。VariantPro™ Mitochondrion Panel是按100%扩增覆盖线粒体基因组（16,569 bp）设计，一步完成mtDNA罕见突变的准确检测，实现了高性价比，5min人工操作，以及超高分辨率。

 
图1a RelayPCR™
一步实现靶向序列捕获和文库制备的全过程

 
图1b Omega Primer™
三个功能区，即大幅提升特异性，又具有宽容模板变异的能力

研究过程

在这项研究中，研究人员运用VariantPro™靶向测序文库制备技术在缺血条件下鉴定人类动脉平滑肌细胞（HASMCs）中可能存在的mtDNA突变。分别提取正常培养条件下和无血清培养条件下（5h）细胞的总DNA，然后，在两组中随机挑选3个浓度约为5-10ng的DNA样本参与VariantPro™捕获反应。最后在Hiseq 4000平台上进行测序。

所用技术：VariantPro™靶向测序文库制备技术

取材：
对照组（正常培养条件下的HASMCs）
实验组（无血清培养条件下的HASMCs）
样本所需量：5-10ng
测序平台：Hiseq 4000

研究结果

在评定高通量测序数据准确度中，Illumina对Q30的标准是>75%，而本研究中产生的高通量数据Q30>94%,表明测序质量的可信度高。此外，VariantPro™ Mitochondrion Panel捕获的所有扩增子的平均覆盖度>Mean值的20%，大部分（>86.83%）扩增子的覆盖度差异倍数在1个Log10之内,说明文库均一性比较好，文库质量比较高。这也证实VariantPro™靶向测序文库制备技术效果很好，测序结果可靠。

 
图2 Amplicon覆盖均一性高达100% at ≥0.2×Mean

测序结果与线粒体基因组比对，以筛选出可能的突变。研究人员分析了对照组和实验组样本中的单核苷酸多态性（SNP），插入，删除，以及所有线粒体基因的相关突变频率。结果发现有3个基因插入或缺失，12个基因有SNP。并且这些突变同时发生在对照组和实验组样本中，两者之间没有显著的差异。

 
图3 mtDNA基因突变频率

这个结果对于研究mtDNA突变非常重要，原因有二。其一，发现正常对照组也有一些mtDNA突变。这个结果暗示，研究人员不仅需要使用标准参考基因组，也需要使用正常对照组的测序数据，旨在确定mtDNA突变。其二，在基因表达研究中，细胞转染是一种通用的技术，无血清培养是一种常规的做法。因而研究人员没有在短期缺血的HASMCs中发现任何mtDNA突变，表明用于基因表达研究的常规无血清培养在细胞转染实验是安全的，实验方案是可靠的。

研究结论

在这项研究中，高水平的测序质量指标证实VariantPro™靶向测序文库制备技术效果很好，从VariantPro™文库产生的测序结果是可靠的。测序结果与文献报道的mtDNA高突变率一致，证实用于基因表达研究的常规无血清培养在细胞转染实验中是安全的。

用户文章
Li XQ, et al. (2016) Short-term serum deprivation causes no significant mitochondrial DNA mutation in vascular smooth muscle cells revealed by a new next generation sequencing technology. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. doi: 10.1093/abbs/gmw059.

本研究中的线粒体突变检测使用联川生物的VariantPro™ Mitochondrion Panel。

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