江南大学****发表CRISPR成果

6月16日Nature子刊《Scientific Reports》在线发表了江南大学食品科学与技术国家重点实验室的一项研究成果。在这项研究中，研究人员构建了一种酿脓链球菌CRISPR/Cas9系统，由一个一体化的敲除质粒组成，其包含一个靶向特异性的引导RNA、cas9和一个同源修复模板，可用于枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的高效基因敲除。

　　

生物通报道：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 6051a是用于酶工业生产的一种野生菌株。因为它的转化效率较低，因此对这一菌株的遗传操作，需要一种高度有效的基因组编辑方法。6月16日Nature子刊《Scientific Reports》在线发表了江南大学食品科学与技术国家重点实验室的一项研究成果，题为“Multigene disruption in undomesticated Bacillus subtilis ATCC 6051a using the CRISPR/Cas9 system”。在这项研究中，研究人员构建了一种酿脓链球菌CRISPR/Cas9系统，由一个一体化的敲除质粒组成，其包含一个靶向特异性的引导RNA、cas9和一个同源修复模板，可用于枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的高效基因敲除。

本研究通讯作者是江南大学研究生院副院长、教授、博士生导师吴敬，吴敬教授系中国药科大学微生物与生化药学博士，美国密歇根大学生化与分子生物学博士后，结构生物学助理研究员。主要从事酶制剂相关领域的教学和科研工作。近年来主持863课题、国家自然科学基金以及江苏省工业支撑等多项国家省部级项目，在相关领域主流刊物上发表SCI论文70多篇。去年吴敬教授入选教育部2015年度****特聘教授。相关阅读：最新****特聘教授公示名单（生物类）。

枯草芽孢杆菌是一种良好表征的革兰氏阳性细菌，被广泛用于不同蛋白质的生产。这个物种及其一些近缘种，有着良好的蛋白质分泌能力，被普遍认为是安全的，从而使它们成为抗生素、药用蛋白质和工业酶生产的重要宿主。枯草芽孢杆菌168是携带许多突变的一种实验室模式菌株，转化能力得以改善。苦草芽孢杆菌菌株通常被用作重组蛋白的生产，如WB600和WB800，是在苦草芽孢杆菌168的基础上被构建的。

由于枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的重组蛋白生产能力超过； 枯草芽孢杆菌168，因此它已被广泛用来生产工业酶。然而，枯草芽孢杆菌ATCC 6051a有一些野生的特性，阻碍了重组蛋白的胞外生产。尤其是，它能在发酵过程中会产生大量的泡沫、高度耐药性的孢子、多种类型的胞外蛋白酶和高水平的淀粉酶。

为了改善这种重要菌株的有用性，研究人员试图通过灭活5个基因，来修改这些特性。相比较实验室菌株，枯草芽孢杆菌ATCC 6051a转化效率低下，因为它包含一个84kb的内生质粒pBS32，其编码一个单程的转膜蛋白ComI——可抑制DNA吸收的能力。由于其能力较差，枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的遗传操作很难，并且需要一种高效的基因编辑方法。最近，有研究人员确定了枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组序列，这便于我们对其进行遗传操作。

CRISPR/Cas系统近年来成为热门技术，一些CRISPR/Cas系统需要多个蛋白质，而II型CRISPR/Cas系统需要一个核酸酶Cas9。在广泛使用的酿脓链球菌II型CRISPR/Cas系统中，在crRNA中一段20bp的互补区域（N20），可引导Cas9核酸酶到达其特异性靶点，一段大约20nt的序列，称为protospacer，在其3’端包含一段特定的protospacer-adjacent motif (PAM)。PAM序列带领cas9在protospacer序列产生双链断裂，它是通过同源重组修复的。

最近，有研究人员开发出了包含crRNA和tracrRNA特征的嵌合的引导RNA（sgRNA），可简化基因组编辑设计。作为一种高效的基因组编辑技术，II型CRISPR/Cas9系统已被证明在点突变、单基因缺失/插入和大型基因簇删除方面，是切实可行的。直到最近，它已被广泛应用于各种生物，包括但不限于大肠杆菌、肺炎链球菌、酿酒酵母、罗伊氏乳杆菌、家蚕、果蝇、小鼠和人类细胞系。

尽管已有几项研究在微生物系统中成功实施了CRISPR/Cas9系统，但是在枯草芽孢杆菌中利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑，还没有相关报道。这项研究在枯草芽孢杆菌ATCC 6051a中建立和优化了CRISPR/Cas9系统。该研究小组使用这一系统，破坏了枯草芽孢杆菌ATCC 6051a中的五个基因（srfC, spoIIAC, nprE, aprE和amyE），这些基因阻碍了它在工业发酵过程中的用途。与枯草芽孢杆菌ATCC 6051a相比，这一突变株——称为BS5，可在控制水平上产生更少的泡沫，对孢子形成表现出极大的抵抗性，并向发酵培养基中分泌了2.5倍多的β-环糊精糖基转移酶（β-CGTase）。β-CGTase被广泛用于β-环糊精的生产，并主要用野生菌株和大肠杆菌生产，这分别存在低分泌性和食品安全的问题。从枯草芽孢杆菌分泌的β-CGTase增加，可以在很大程度上降低β环糊精生产的成本，这显示出了BS5极高的工业价值。

本月还有几项关于CRISPR的研究成果，例如，6月1日，哈佛医学院著名的遗传学教授George Church以通讯作者身份，在国际著名期刊《The FEBS Journal》发表题为“Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators”的综述文章，畅谈CRISPR这项革命性技术的下一站：RNA引导的表观遗传学调节因子。相关阅读：遗传学大牛谈CRISPR革命的下一站。

来自华中农业大学、中科院武汉病毒研究所、巴基斯坦医学科学研究所以及华中科技大学同济医学院的研究人员，在国际著名学术期刊《Oncotarget》发表题为“CRISPR/Cas9 therapeutics: a cure for cancer and other genetic diseases”的综述文章。相关阅读：华中农大CRISPR疗法综述刊登国际期刊。

6月10日，国际著名学术期刊《Journal of Biological Chemistry》在线刊登了广州医科大学第三附属医院孙筱放教授带领的一项研究成果，该研究小组将ssODNs与CRISPR/Cas9介导的基因组编辑相结合，来特异性地靶定HBB基因CD41/42 (-CTTT)突变。相关阅读：广州医科大学用CRISPR纠正地贫突变。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Multigene disruption in undomesticated Bacillus subtilis ATCC 6051a using the CRISPR/Cas9 system
Abstract: Bacillus subtilis ATCC 6051a is an undomesticated strain used in the industrial production of enzymes. Because it is poorly transformable, genetic manipulation in this strain requires a highly efficient genome editing method. In this study, a Streptococcus pyogenes CRISPR/Cas9 system consisting of an all-in-one knockout plasmid containing a target-specific guide RNA, cas9, and a homologous repair template was established for highly efficient gene disruption in B. subtilis ATCC 6051a. With an efficiency of 33% to 53%, this system was used to disrupt the srfC, spoIIAC, nprE, aprE and amyE genes of B. subtilis ATCC 6051a, which hamper its use in industrial fermentation. Compared with B. subtilis ATCC 6051a, the final mutant, BS5 (ΔsrfC, ΔspoIIAC, ΔnprE, ΔaprE, ΔamyE), produces much less foam during fermentation, displays greater resistant to spore formation, and secretes 2.5-fold more β-cyclodextrin glycosyltransferase into the fermentation medium. Thus, the CRISPR/Cas9 system proved to be a powerful tool for targeted genome editing in an industrially relevant, poorly transformable strain.