中科大施蕴渝院士JBC发表新成果

　　

生物通报道：6月15日，国际学术期刊《Journal of Biological Chemistry》在线刊登了中国科技大学的一项研究成果，题为“Structural Basis for the Specific Recognition of RhoA by the Dual GTPase-activating Protein ARAP3”，这项研究解析了RhoA蛋白的晶体结构。中国科技大学生命科学学院的施蕴渝院士和吴季辉教授，是本文共同通讯作者。延伸阅读：中科大施蕴渝院士解析重要蛋白结构；中国科技大学Cell子刊发表RNA研究新成果；中科大院士JBC解析重要蛋白复合体结构。

在人类中，小的GTP酶Ras超家族是由至少154个成员组成，被分成五个主要家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran家族。这些蛋白质作为分子开关，在一种不活跃的GDP结合形式和一种活跃的GTP结合形式之间循环，将来自质膜受体的信号转换成下游信号分子。

这些小的GTP酶通常有较低的GTP酶水解活性，并且高效的水解需要与家族特异性的GAPs（GTP酶激活蛋白，可通过几个数量级加快裂解步骤）相互作用。Arf6是一个Arf家族成员，参与内吞途径、核内体再循环、细胞迁移、胞外分泌、肌动蛋白重组、质膜重组和胞质分裂。RhoA属于Rho家族，主要通过诱导细胞中的应力纤维调节细胞的形状、极性和运动性。此外，Arf6在癌细胞入侵中发挥一定的作用，RhoA调节着癌细胞的形态和迁移。

ARAP3——一个多域蛋白，属于ARAP超家族蛋白，并包含功能性的ArfGAP和RhoGAP结构域，一个SAM结构域和一个RA结构域。在筛选PtdIns P3 结合蛋白的过程中，ARAP3最初被认定为一个PI3K效应物。ARAP蛋白是在不同水平上被调控的。据证明，ARAP3的ArfGAP活性是由磷酸肌醇PtdIns P3和PtdIns P2诱导的，而它的RhoGAP活性在体外是不受影响的。此外，ARAP3的RhoGAP是通过Rap1-GTP与RA结构域的直接结合而上调的。

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ARAP3是独一无二的，因为它的两个不同的功能性GAPs：ArfGAP和RhoGAP，它们分别特异性地作用于Arf6和RhoA。这个特性很可能提供了一种有效的方式来协调这两个信号过程。然而，ARAP3对Rho和Arf GTP酶的特异性的根本机制，尚未得以彻底的表征。

在这项研究中，研究人员集中在ARAP3中RhoGAP的结构和功能。众所周知，ARAP3通过其RhoGAP 活性，调节着许多细胞功能，例如生长因子刺激后的板状伪足形成、PI3K信号通路中血管生成的发育、胃癌细胞腹膜传播的抑制。

Rap1-GTP可以上调ARAP3的RhoGAP活性，因此ARAP3在下游Rap1-GTP细胞过程中的作用，是RhoGAP依赖性的。在中性粒细胞中，ARAP3可调节趋药性和粘附依赖性过程。在巨噬细胞中，在长期的TGF-β1处理之后，ARAP3可抑制趋化因子的产生，并减缓细胞迁移。ARAP3介导来自PC12细胞的突起生长，以响应碱性成纤维细胞生长因子、神经生长因子和cAMP的处理，它们都上调PC12细胞中的Rap1-GTP水平。然而，ARAP3-RhoGAP/RhoA相互作用的本质，仍然是未知的。

为了确定ARAP3-RhoGAP结构域的结构和功能，该研究小组解析了RhoGAP结构域的X射线晶体结构，以及复杂的RhoA/RhoGAP结构域的晶体结构。通过分析这些晶体结构，结合GTP酶活性检测和ITC（等温滴定量热法）实验，研究人员确定了影响RhoGAP活性和底物特异性的重要残基。另外，研究人员绘制了RhoA和ARAP3-RhoGAP结构域之间的界面。利用复杂的结构作为指导，研究人员进行了定点诱变，以分析界面残基在络合物形成和GTP水解中的作用。

（生物通：王英）

注：施蕴渝，生物物理 学与结构生物学家。1997年当选为中国科学院院士，博士生导师。2009年当选为发展中国家科学院院士。中国科学技术大学生命科学学院教授。1965年毕业于中国科学技术大学物理系生物物理专业。1965年-1970年卫生部中医研究院实习研究员。1970年-至今年中国科学技术大学助教，讲师，副教授，1教授。合肥微尺度物质科学国家实验室（筹）研究员。1979年-1981年意大利罗马大学化学系，CNRS结构化学实验室进修。曾作为访问学者在荷兰格罗宁根大学物理化学系，法国CNRS酶学与结构生物学实验室，法国理论化学实验室进修或合作研究。

吴季辉，教授，博士生导师。籍贯福建。1982年毕业于中国科学技术大学生物系细胞生物学专业，1988在中国科学院生物物理所获理学硕士学位。毕业后在中国科学技术大学生命科学学院任教并从事核磁共振和结构生物学的研究工作。曾于1995年在瑞士苏黎士联邦高工分子生物和生物物理研究所进修核磁实验技术及蛋白质结构修正方法。主要研究兴趣：蛋白质和核酸的核磁共振研究及生物核磁共振波谱学方法学研究，特别是蛋白质的结构测定及结构和功能关系，以及蛋白质-蛋白质，蛋白质-核酸，蛋白质-配基相互作用,结构基因组学研究中适于高通量结构测定以及代谢组学中的核磁共振方法学研究。

生物通推荐原文摘要：
Structural Basis for the Specific Recognition of RhoA by the Dual GTPase-activating Protein ARAP3
Abstract：ARAP3 (Arf-GAP with Rho-GAP domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 3) is unique for its dual specificity GAPs (GTPase activating protein) activity for Arf6 (ADP-ribosylation factor 6) and RhoA (Ras homolog gene family member A) regulated by PtdIns(3,4,5)P3 (phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate) and a small GTPase Rap1-GTP and is involved in regulation of cell shape and adhesion. However, the molecular interface between the ARAP3-RhoGAP domain and RhoA is unknown, as is the substrates specificity of the RhoGAP domain. In this study, we solved the crystal structure of RhoA in complex with the RhoGAP domain of ARAP3. The structure of the complex presented a clear interface between the RhoGAP domain and RhoA. By analyzing the crystal structure and in combination with in vitro GTPase activity assays and ITC (isothermal titration calorimetry) experiments, we identified the crucial residues affecting RhoGAP activity and substrates specificity among RhoA, Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) and Cdc42 (Cell division control protein 42 homolog).