Science子刊：微量小RNA深度测序技术分析

　　

　　6月10日，国际著名学术期刊Science子刊Science Advances在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心（上海）吴立刚研究组与上海市计划生育研究所施惠娟研究组合作的最新研究成果“Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos”，该研究优化建立了适用于微量样本的小RNA深度测序（deep sequencing）文库构建方法，并系统解析了小鼠早期胚胎发育过程中小RNA的动态变化及其生物学功能。

　　目前小RNA深度测序的文库构建通常要几百纳克（ng）总RNA，研究配子和胚胎等难以大量获取的生物学样品中的小RNA表达谱较为困难。该研究通过优化基于连接反应的小RNA文库构建方法，使得总RNA用量降低了几十倍，仅需要10纳克总RNA即可在Illumina测序仪上实现对小RNA的深度测序，为研究配子、胚胎和各种干细胞中的小RNA提供了重要技术支撑。该研究利用优化的方法系统解析了小鼠卵子到受精后8细胞胚胎发育过程中的小RNA动态变化，发现小鼠卵子和早期胚胎主要包含三类小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的这三类小RNA绝大多数来源于卵子，由精子带入卵子的小RNA不足几百分之一。随着胚胎的发育，母源endo-siRNA和piRNA逐渐被缓慢降解。而母源miRNA的降解较快，主要发生在胚胎2细胞期前后，其中有近20%的miRNA 3’末端被加上了一个或四个腺苷酸（A），其降解速率与未被腺苷酸化的miRNA相比明显减缓，推测可能3’末端腺苷酸化发挥了保护作用，使某些miRNA免于在母型至合子型转化中被快速清除。合子中新表达的miRNA最早出现在受精卵第一次分裂前，并随着胚胎的发育持续被激活表达，特别是进化保守的miRNA的表达量迅速上升。研究人员进一步结合小鼠早期胚胎发育的转录组数据进行分析，发现miRNA在卵子到胚胎2细胞期中几乎没有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8细胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能开始逐步恢复，并对合子激活表达的基因有明显的靶向抑制作用。以上研究不仅揭示了小鼠早期胚胎发育中miRNA的表达和降解规律，还发现了miRNA对靶基因的调控活性随着胚胎发育而被动态调控的现象，对于理解miRNA在早期胚胎发育中的功能和机制具有重要意义。

　　杨其元、林济民、刘淼为该论文共同第一作者，李逸平课题组的李荣红对深度测序数据分析做出了重要贡献，吴立刚、施惠娟为共同通讯作者。该工作的数据收集工作得到生化与细胞所公共技术服务中心分子生物学技术平台的技术支持，经费上得到了国家科技部、国家基金委和上海市科委的支持。

 

　　小鼠卵细胞和早期胚胎中微量小RNA深度测序方法原理及其测序结果。(A)微量小RNA深度测序cDNA文库构建流程图。(B)小鼠卵细胞以及早期胚胎发育各个时期的样本。(C)不同样本中小RNA的组成及长度分布图。小鼠CD4+ T细胞(CD4)是体细胞对照。

原文摘要：

Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos

Small RNAs play important roles in early embryonic development. However, their expression dynamics and modifications are poorly understood because of the scarcity of RNA that is obtainable for sequencing analysis. Using an improved deep sequencing method that requires as little as 10 ng of total RNA or 50 oocytes, we profile small RNAs in mouse oocytes and early embryos. We find that microRNA (miRNA) expression starts soon after fertilization, and the mature miRNAs carried into the zygote by sperm during fertilization are relatively rare compared to the oocyte miRNAs. Intriguingly, the zygotic miRNAs display a marked increase in 3′ mono- and oligoadenylation in one- to two-cell embryos, which may protect the miRNAs from the massive degradation taking place during that time. Moreover, bioinformatics analyses show that the function of miRNA is suppressed from the oocyte to the two-cell stage and appears to be reactivated after the two-cell stage to regulate genes important in embryonic development. Our study thus provides a highly sensitive profiling method and valuable data sets for further examination of small RNAs in early embryos.