中山大学等开发RNA编辑新工具

　　

生物通报道：CRISPR-Cas9系统使用一段引导RNA（其与Cas9蛋白结合起来才能发挥作用）来靶定一段DNA，并裂解双链DNA。这一现象提出了一个问题：由一个Dicer结合RNA元件和一段反义RNA组成的一种人造小RNA（asRNA，是否也能用来诱导Dicer处理和降解一段特定的RNA呢？

为此，5月25日在国际肿瘤期刊《Oncotarget》发表的一项研究中，来自中山大学、深圳大学第一附属医院、汕头大学等处的研究人员开发出一种新的方法——命名为DICERi，用于基因沉默或RNA编辑。中山大学生命科学学院的张勇教授、深圳大学第一附属医院的Weiren Huang和Zhiming Cai是这篇论文的共同通讯作者。

作为细菌和古生菌的适应性免疫防御，CRISPR/Cas9系统已经成为一种常规和强大的工具，用于基因组编辑，特别是II型细菌CRISPR/Cas9系统。CRISPR位点是由一系列的重复序列组成，被“间隔区”序列分开。“间隔区”序列与噬菌体的基因组以及其他易变的遗传元件相匹配。重复间隔阵列被转录并处理以生成一段小crRNA，来识别靶序列。重复间隔区阵列两侧的元件是编码Cas9的CRISPR/Cas9基因，即使用crRNA来引导靶位点裂解的一段双链DNA核酸内切酶。

在靶位点下游的一段序列基序——称为protospacer-adjacent motif (PAM)，对于裂解是至关重要的。CrRNA到Cas9的装载，也需要一段小的tracrRNA，它被反转录成crRNA前体和RNase III。现在，科学家们已经成功地将crRNA与tracrRNA融合，来产生小的引导RNA，以简化这个系统。

索取Lifetech GeneArt CRISPR产品的详细技术资料请填写联系方式

RNA干扰（RNAi）已经对我们关于“遗传信息表达的调控机制”的观点，提出了挑战。它表明，在真核生物中，蛋白质和RNA分子都能调控基因的表达。首先，在细胞核中，Drosha将一段50-70nt的茎环前体（pre-miRNA）从一段初级转录物（pri-miRNA）上切除。然后，细胞核转运受体exportin-5，将pre-miRNA运输到细胞质中。随后，pre-miRNA被Dicer裂解，从而生成了一段短的19-23nt的复式结构，在3’端具有2nt的悬突，5’末端被磷酸化。在短的复式结构被加载到一个多元核酸酶RISC上之后，一条链被释放和降解，另一条链仍然被切断为一段引导序列，来指导RISC破坏互补性的信使RNA（mRNA）。

受到CRISPR/Cas9系统的角色模型的启发，该研究小组想知道，是否我们能够引入一段人造的小RNA（asRNA，由Dicer结合RNA元件和一段反义RNA组成），来诱导Dicer处理和降解一段特定的RNA，就如同CRISPR/Cas9系统中用引导RNA来诱导Cas9裂解靶序列。

该研究小组开发出一种新方法，使用一段低聚物RNA作为一个蛋白质结合RNA元件，来诱导Dicer降解靶RNA。首先，他们选择MALAT-1作为靶基因，并构建了一个asRNA表达载体。然后，他们测量了这些装置对表达水平和表型变化的影响，例如细胞增殖、细胞迁移和细胞凋亡。

研究结果表明，与阴性对照相比，这种新方法能显著抑制靶基因的表达水平以及功能。接下来，该研究小组共转染了靶定Dicer的shRNA和对抗MALAT-1的asRNA，以确认抑制作用是由Dcier诱导的。DNA编辑或RNA编辑都已经广泛用于生物学和治疗学目的。它们能够特异性地激活或抑制DNA或RNA，以调节基因网络。相关阅读：RNA编辑技术治疗严重罕见病；Cancer Research：RNA编辑与食管癌；曹雪涛院士亮点推荐Science文章：重要的RNA编辑。

在这项研究中，研究人员重新改造了Dcier，并向RNA编辑添加了另一个成员。不同实验方法的结果证实，这种假设是正确的。然而，进一步的工作——比如改善反义RNA和靶RNA之间的特定结合，应该能够使这种新方法更具有适用性。

总而言之，这种新的方法是用于RNA编辑的一种新型、有效的工具，可能对于指导和重新连接基因网络，具有广泛的用途。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Artificial small RNA for sequence specific cleavage of target RNA through RNase III endonuclease Dicer
ABSTRACT：CRISPR-Cas9 system uses a guide RNA which functions in conjunction with Cas9 proteins to target a DNA and cleaves double-strand DNA. This phenomenon raises a question whether an artificial small RNA (asRNA), composed of a Dicer–binding RNA element and an antisense RNA, could also be used to induce Dicer to process and degrade a specific RNA. If so, we could develop a new method which is named DICERi for gene silencing or RNA editing. To prove the feasibility of asRNA, we selected MALAT-1 as target and used Hela and MDA-MB-231 cells as experimental models. The results of qRT-PCR showed that the introduction of asRNA decreased the relative expression level of target gene significantly. Next, we analyzed cell proliferation using CCK-8 and EdU staining assays, and then cell migration using wound scratch and Transwell invasion assays. We found that cell proliferation and cell migration were both suppressed remarkably after asRNA was expressed in Hela and MDA-MB-231 cells. Cell apoptosis was also detected through Hoechst staining and ELISA assays and the data indicated that he numbers of apoptotic cell in experimental groups significantly increased compared with negative controls. In order to prove that the gene silencing effects were caused by Dicer, we co-transfected shRNA silencing Dicer and asRNA. The relative expression levels of Dicer and MALAT-1 were both detected and the results indicated that when the cleavage role of Dicer was silenced, the relative expression level of MALAT-1 was not affected after the introduction of asRNA. All the above results demonstrated that these devices directed by Dicer effectively excised target RNA and repressed the target genes, thus causing phenotypic changes. Our works adds a new dimension to gene regulating technologies and may have broad applications in construction of gene circuits.