Cancer Cell: lncRNA通过外泌体传播耐药性——锐博生物解读

　　

近日，二军大长征医院的王林辉及东方肝胆外科医院王红阳研究团队在Cancer Cell上发表文章，发布了关于lncRNA参与肾癌靶向药物耐药形成和通过外泌体播散的研究成果，将国内lncRNA和外泌体的研究热点又一次推向了高潮。本文思路严谨，视角新颖，对肿瘤耐药机制及外泌体研究极具指导意义，下面请大家和小编一起来阅读吧！

如何筛选出功能性lncRNA？

为了找到舒尼替尼耐药的RCC细胞 (以下简称为耐药细胞) 所需的lncRNA，研究者使用了lncRNA芯片检测亲本细胞和耐药细胞的表达差异，并进行qRT-PCR、病人源性异种移植模型 (PDX) 实验，在候选的24条lncRNA中，有8条在药物应答较弱的PDX中上调，但在应答较好的样本中不会，于是选择它们进一步做功能缺失性实验；其中一条lncRNA被干扰后，其耐药性的阻遏效果比其他7条明显，于是研究者将它命名为lncARSR (Activated in RCC with Sunitinib Resistance) 。通过RACE确定它的全长为591nt，Northern blot、LNA-based ISH分别确认它在耐药细胞中、复发后肿瘤中表达丰富。

进一步发现lncARSR的功能

研究者使用慢病毒shRNA载体敲降耐药细胞内的lncARSR，结果IC50 减少，非贴附性生长受到抑制，还抑制STAT3、AKT、ERK信号通路，修复耐药细胞对舒尼替尼的应答。因此，lncARSR是耐药细胞所必需的。

肾癌组织中和血浆中lncARSR表达较低者对舒尼替尼治疗有较好反应性，而表达较高者对舒尼替尼治疗的反应性不佳，据此提出lncARSR可作为有效的肾癌舒尼替尼治疗疗效预判的组织学和血清学标志物。

外泌体与lncARSR

令研究者好奇的是，胞外的lncARSR到底是以何种形式存在的呢？RNase处理后，细胞培养基中的lncARSR水平不变，但同时添加Triton X-100后，显著减少，表明lncARSR很可能是被膜结构包裹着的。于是，研究者从细胞培养基提取外泌体 (以下简称exo)，并用exo标志物TSG101和CD9鉴定。exo中的lncARSR水平与细胞培养基的基本相当，即exo是胞外lncARSR的主要载体。耐药细胞来源的exo-lncARSR水平比亲本细胞高。

那么lncARSR是怎么进入exo的呢？

研究者使用lncARSR探针，对细胞质提取物进行RNA pull down，发现lncARSR与核不均一性核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)相互作用。研究者通过RIP实验、敲降hnRNPA2B1实验，证明hnRNPA2B1负责将lncARSR包裹进exo。 

RIP实验，与IgG相比，lncARSR在耐药细胞的胞质和exo裂解液中富集更多hnRNPA2B1。右图，RIP实验的PCR产物跑胶图。hnRNPA2B1主要分布于细胞核，但它与lncARSR的相互作用在细胞质、exo中更多，证明hnRNPA2B1直接将lncARSR打包进exo

转运lncARSR的exo，有什么作用？

孵育耐药细胞来源的exo后，细胞内的lncARSR增加，而从敲降了lncARSR的耐药细胞提取的exo并没有此效果。转运lncARSR的exo还能将耐药表型赋予给受体细胞。 

 
将图中所示的exo孵育786-O细胞后，qRT-PCR分析lncARSR水平。正常肾细胞HK2 exo作为阴性对照；786-O，亲本细胞；7Su3rd，耐药细胞

 
将FITC-lncARSR(绿色)电转至786-O细胞，提取exo，添加Dil标签(红色)，孵育786-O细胞48h，在受体细胞中观察到FITC和Dil的共定位，表明细胞内化了含FITC-lncARSR的exo

lncARSR功能的分子机制 

 
在耐药细胞中，lncARSR作为内源性竞争RNA结合miRNA-34和miRNA-449家族，解除了miRNA-34和miRNA-449家族对受体型酪氨酸激酶AXL和c-MET的抑制作用，从而促进AXL和c-MET表达及下游STAT3、AKT、ERK信号通路的活化，最终导致舒尼替尼耐药的形成。同时，活化的AKT可以磷酸化FOXO1和FOXO3a，促进其在胞浆滞留和降解，从而解除了FOXO1和FOXO3a对lncARSR的转录抑制作用，形成了细胞内lncARSR依赖的正反馈环路，维持肾癌细胞舒尼替尼耐药表型

研究者还进一步评估了lncARSR及其下游靶分子AXL和c-MET作为治疗肾癌舒尼替尼耐药靶点的价值，发现靶向lncARSR或抑制AXL/c-MET可恢复耐药性肾癌对舒尼替尼的敏感性，提出了逆转肾癌舒尼替尼耐药的治疗策略。

研究者的该项肾癌转化医学研究发现了肾癌患者发生舒尼替尼耐药的新机制，并提出了lncARSR可作为肾癌舒尼替尼治疗疗效预判的有效分子标志物和干预靶点，为肾癌个性化靶向治疗提供了新的思路和视角。

本研究所使用的miRNA mimic和inhibitor由锐博生物提供。

原文：Qu L, et al. Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA. Cancer Cell. 2016 Apr 21.

本文第一作者曲乐博士已应邀参加6月份在广州举办的2016非编码RNA交流会，分享本课题的研究经验，欢迎大家前来参会交流！